论文摘要
在哺乳动物的胚胎着床过程中,胚泡侵入性和子宫内膜接受态的建立是保证成功着床的关键。在这一“着床窗口期”,雌、孕激素通过细胞内受体作用于子宫内膜使内膜间质水肿、血管充血,为胚胎着床提供物质基础;同时子宫内膜细胞分泌大量细胞因子、黏附分子、蛋白水解酶等。各种着床相关因子的表达随妊娠进程发生变化,促进胚胎与子宫内膜相互识别、黏附。细胞膜表面结合的糖蛋白、糖脂等糖缀合物中的聚糖可参与特异的生物信息传递。LewisY聚糖（LeY）在哺乳动物着床期的子宫内膜上皮细胞和胚泡中持续高表达;“着床窗口期”有特异LeY糖蛋白出现;LeY作为中介分子参与母-胎识别、黏附,并在激素调节下作为信息分子参与着床调控;着床前高分泌LeY的胚泡发育速度快、着床能力高。因此,胚胎和子宫内膜细胞表面的LeY聚糖表达,可能作为胚胎发育成熟和着床的功能性指标。调控LeY聚糖合成的关键酶（α1,2-岩藻糖基转移酶,FUT1）基因表达可以调控聚糖的合成,而由此对胚胎着床过程进行调控,这为干预胚胎着床提供新的方法和思路。白血病抑制因子（LIF）是介导胚泡着床最主要的细胞因子,LIF作为胚胎营养因子可促进胚胎发育及提高移植成功率,且LIF在人、鼠等哺乳动物的子宫内膜上规律表达也成为胚泡成功植入的保证。细胞表面的β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ（β1,4-GalTⅠ）作为一种细胞黏附分子,参与细胞的黏附、铺展,精卵识别,神经轴突生长,组织形成和肿瘤转移,而胚胎着床与肿瘤转移、侵袭过程非常相似。本文主要观察LeY、LIF和β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ对胚胎发育和着床的调节,研究LIF、β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ对子宫内膜细胞LeY表达的相关性,探讨着床因子相互关系以深化胚胎着床调控机理。论文主要方法和结果如下:（一）制备妊娠第三天（D3）的子宫内膜上皮细胞并进行分组,以FUT1siRNA抑制LeY合成的关键酶基因FUT1以及通过细胞中加入LIF（10ng/ml）,研究其对胚胎着床的影响。结果显示:与正常组及对照组相比,细胞转染FUT1siRNA后,RT-PCR检测其FUT1基因表达降低,Dot-blot分析其LeY合成相应下降;而LIF对子宫内膜上皮细胞FUT1基因表达有明显促进作用,且LeY的合成增高;体外胚胎着床模型观察到:抑制FUT1基因表达后,胚胎的黏附率和扩展生长率（32.7%）低于正常培养组（40.7%）和干扰对照组（40.0%）,而LIF促进FUT1基因表达进一步提高了胚胎的黏附率和扩展生长率（52.0%）（对照组为37.3%）。表明细胞表面LeY聚糖表达水平影响胚胎与子宫上皮细胞间的识别、黏附,并可通过调节LeY聚糖合成关键酶基因来影响LeY的合成,进一步调控胚胎着床。此外,LIF可能通过上调细胞表面LeY表达来调节母-胎之间的识别和黏附。（二）收集人工助孕体外胚胎培养过程中的胚胎培养液,Dot-blot检测单胚胎培养液中LeY的分泌水平,并分析胚胎发育速度、胚胎质量、移植胚胎选择与胚胎LeY分泌水平的相关性。结果表明:人胚胎从4-细胞期起即有LeY的分泌,随着胚胎的发育LeY表达逐渐增高;选择不同患者发育时期相同的胚胎培养液检测提示:发育时期相同的胚胎LeY分泌水平不同;同一患者的发育时期相同的不同胚胎培养液检测提示:LeY分泌水平也不同。LeY高分泌的胚胎,在受精后D3发育到6-细胞以上的胚胎数（37/45）明显高于LeY低分泌的胚胎数（18/30）;用于移植的胚胎数（71.1%）也高于低分泌的胚胎数（40.0%）。表明LeY能促进胚胎发育、提高胚胎质量,有望成为选择优秀胚胎的诊断指标。（三）将已构建好的β1,4-GalTⅠ基因干扰质粒和过表达质粒分别转染人子宫内膜细胞（RL95-2）,分析转染后对LeY表达的影响及其在胚胎着床中的作用。质粒转入RL95-2细胞60h后,荧光显微镜检测和细胞化学染色显示:与正常培养组、空载体组和干扰对照组相比,干扰组细胞内绿色荧光蛋白表达弱,合成Galβ1-4GlcNAc明显降低;过表达组绿色荧光蛋白表达强,合成Galβ1-4GlcNAc明显增高,说明质粒转染效果良好。抑制β1,4-GalTⅠ的基因表达,LeY合成的关键酶基因FUT1表达下降,LeY合成降低,胚胎的黏附率和扩展生长率（26.7%）低于正常培养组（56.0%）、空载体组（56.0%）和干扰对照组（53.3%）;过表达β1,4-GalTⅠ,FUT1基因表达和LeY合成均增高,胚胎的黏附率和扩展生长率（66.7%）也明显增高。结果提示β1,4-GalTⅠ参与胚胎着床,并可能通过影响细胞表面的LeY聚糖表达来调节母-胎之间的识别和黏附。β1,4-GalTⅠ对胚胎着床的调控机理有待于进一步深入探讨。