扇贝异源多倍体与四倍体培育技术研究

论文摘要

1栉孔扇贝（Chlamys farreri）♀×海湾扇贝（Argopecten irradians）♂异源三倍体诱导及细胞遗传学研究受精过程荧光显微观察表明,选择充分促熟的亲贝,20℃水温下,远缘杂交可以顺利进行。精子入卵后可以激活卵子完成减数分裂,进而精卵原核融合,卵裂,早期胚胎能够正常发育。观察初步证实异源精子参与了后代遗传物质的组成,具备异源多倍体诱导操作的可行性。以50%的受精卵排出第1极体为诱导时机,以60 mg/L 6-DMAP为诱导剂量,处理15min,平均三倍体诱导率可达88.56%,孵化率可达53.52%。孵化后幼虫生长缓慢,死亡严重。受精后14天壳长仅为148μm左右,远低于自交对照组（173μm）。14天幼虫存活率仅0.00067%。GISH分析表明,诱导获得的三倍体胚胎其染色体组由2套母本染色体组和1套父本染色体组构成,确为异源三倍体。约2%的分裂相出现母本偏向性染色体转变。类型包括染色体片段,及整条染色体的遗传转变。表明异源基因组并不稳定,存在复杂的核-核、核-质相互作用,可能与幼虫不能成活有关。2虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）三倍体诱导与培育尝试低渗法诱导虾夷扇贝三倍体,获得最优诱导条件:12℃水温,以50%的受精卵排出第1极体为处理时机,20‰的盐度条件处理受精卵20min,D形幼虫平均三倍体得率可达91.24%,平均孵化率达52.94%。倍性变化趋势:大规模诱导群体在D形幼虫至2龄成贝期间,以D形幼虫期三倍体率最高,达50.06%。随后,三倍体率急剧下降,到4月龄降至12.07%。从4月龄到8月龄三倍体率下降趋于缓慢,至8月龄降至7.27%。8月龄至24月龄成贝期间三倍体率基本稳定。人工诱导三倍体在4月龄至24月龄期间均未表现出生长优势。24月龄成贝,三倍体平均壳高、壳长、壳宽、总重分别比二倍体对照低8.59%、10.33%、8.79%和24.78%。3虾夷扇贝三倍体（P.yessoensis）育性与四倍体培育三倍体性成熟期比对照晚1月左右。共检测三倍体个体60只。性腺存在不同程度的发育,总体水平低下。雄性先于雌性发育。雄性性腺多为乳白色,个别微泛黄,雌性多为橘红色,个别颜色较淡。性比基本正常,1龄期雌雄比约1:1.18,2龄期雌雄比约1:1.50。未发现雌雄同体个体。雄性三倍体共催产29只,无一排精。电镜检测3只雄性性腺,发现存在大量精子细胞。精核开始浓缩,呈现不规则多边形。部分精子细胞线粒体嵴稀少,甚至呈空泡状。内质网稀少,未发现顶体形成,也未发现成熟精子。雌性三倍体共催产23只,4只排卵。卵子平均直径86.65±2.53μm,比二倍体大10.79%,体积大35.99%。相对育性（产卵量）1龄为3%,2龄为4%。荧光显微观察表明,三倍体的卵子具有受精能力,与二倍体的精子受精后大多数能够类似正常的分裂和发育。约30%的卵子减数分裂异常,染色体行为不同步。3n♀x2n♂,子代主要为非整倍体,约70%幼虫倍性介于2n和3n之间,30%介于3n和5n之间。D形幼虫孵化率仅0.23%,至7日龄未发现存活幼虫。以20‰的盐度条件处理3n♀×2n♂受精卵20min抑制第1极体释放,胚胎最高四倍体率达75.12%。幼虫发育异常迟缓,约受精后65h到达担轮期,120h到达D形期,孵化率平均仅0.09%。7日龄存活率仅0.07%。4三倍体虾夷扇贝（P.yessoensis）基因组甲基化水平的MSAP分析虾夷扇贝三倍体13只二倍体20只,来源于同一诱导群体。9对引物MSAP扩增共得到7206条条带,其中甲基化条带1988条（27.6%）,包括全甲基化1095条（15.2%）,半甲基化893条（12.4%）。主要结论为:（1）虾夷扇贝基因组甲基化水平较高。（2）个体间基因组甲基化水平差异较大。（3）三倍化导致虾夷扇贝基因组甲基化降低。（4）甲基化水平与性别有关。平均总甲基化率:雌性高于雄性。（5）平均总甲基化率:二倍体雌性>二倍体雄性>三倍体雌性>三倍体雄性。（6）三倍化不利于虾夷扇贝雌性性状表达和性腺发育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 海洋贝类多倍体育种研究进展
• 1 贝类多倍体育种研究概况
• 2 贝类多倍体的制备方法及机理
• 2.1 三倍体的制备
• 2.2 四倍体的制备
• 2.3 多倍体诱导的影响因素
• 2.4 多倍体的倍性鉴定
• 3 贝类多倍体的生物学特性
• 3.1 多倍体贝类的存活能力
• 3.2 多倍体贝类的生长
• 3.3 多倍体贝类的性腺发育和繁殖能力
• 3.4 多倍体贝类的性比
• 4 贝类多倍体育种目前存在的问题及前景展望
• 5 本研究的目的与意义
• 第二章 扇贝异源三倍体诱导及细胞遗传学研究
• 第一节 栉孔扇贝（C. farreri）♀×海湾扇贝（A. irradians）♂受精及早期胚胎发育过程的荧光显微观察
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料及主要试剂
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 栉孔扇贝（C. farreri）♀×海湾扇贝（A. irradians）♂受精过程荧光显微观察
• 2.2 杂交受精率与杂种胚胎发育
• 3 讨论
• 第二节 6-DMAP 诱导栉孔扇贝（C. farreri）♀×海湾扇贝（A. irradians）♂异源三倍体
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 异源三倍体诱导条件优化
• 2.2 幼虫生长与存活
• 3 讨论
• 第三节 扇贝异源三倍体染色体组成的 GISH 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 染色体标本制备
• 1.5 探针的制备
• 1.6 封闭DNA 的制备
• 1.7 基因组原位杂交（GISH）
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 3.1 异源三倍体诱导后代的GISH 鉴定
• 3.2 异源基因组的不稳定性与母本偏向性染色体转变
• 第三章 虾夷扇贝（PATINOPECTEN YESSOENSIS）三倍体诱导与培育
• 第一节 低渗法诱导虾夷扇贝（P. yessoensis） 三倍体
• 1 材料与方法
• 1.1 亲贝
• 1.2 精、卵的获得
• 1.3 授精与三倍体诱导
• 1.4 孵化与选优
• 1.5 数据统计
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第二节 虾夷扇贝（P. yessoensis） 三倍体诱导群体的倍性变化
• 1 材料与方法
• 1.1 虾夷扇贝（P. yessoensis）三倍体诱导群体的获得
• 1.2 倍性测定方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第三节 三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）的生长比较
• 1 材料与方法
• 1.1 三倍体群体和二倍体群体的获得
• 1.2 个体标识与倍性检测
• 1.3 生长性状测定
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 3.1 贝类的三倍体优势
• 3.2 虾夷扇贝（P. yessoensis）的三倍体“劣势”
• 第四章 虾夷扇贝（PATINOPECTEN YESSOENSIS）三倍体育性与四倍体培育
• 第一节 三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）的性比
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）性腺观察
• 2.2 三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）的性比
• 3 讨论
• 3.1 性成熟贝龄
• 3.2 性比
• 第二节 雄性三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）育性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 诱导排精
• 1.3 解剖取精
• 1.4 电镜观察
• 2 实验结果
• 2.1 诱导排精
• 2.2 解剖取精
• 3 讨论
• 第三节 雌性三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）育性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 诱导产卵
• 1.3 受精过程细胞学荧光显微观察
• 1.4 子代胚胎染色体组成分析
• 1.5 子代倍性变化趋势分析
• 2 实验结果
• 2.1 雌性三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）的相对育性
• 2.2 三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）卵子大小
• 2.3 虾夷扇贝（P. yessoensis）311♀×211♂受精过程及早期胚胎发育的荧光显微观
• 2.4 虾夷扇贝（P. yessoensis）311♀×211♂子代胚胎的染色体构
• 2.5 虾夷扇贝（P. yessoensis）311♀×211♂子代幼虫倍性变化与存
• 3 讨论
• 3.1 异常减数分裂
• 3.2 311♀×211♂子
• 3.3 繁殖潜力
• 第四节 利用三倍体虾夷扇贝（P. yessoensis）的卵诱导四倍体
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 诱导产卵
• 1.3 四倍体诱导与培育
• 1.4 数据统计
• 2 实验结果
• 2.1 虾夷扇贝（P. yessoensis）四倍体诱导
• 2.2 幼虫生长与存活
• 3 讨论
• 第五章 三倍体虾夷扇贝（PATINOPECTEN YESSOENSIS）基因组甲基化水平的 MSAP 分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 DNA 提取
• 1.3 MSAP 甲基化分析
• 2 结果与分析
• 2.1 MSAP 扩增结果
• 2.2 三倍体与二倍体虾夷扇贝基因组MSAP 分析
• 3 讨论
• 3.1 虾夷扇贝基因组甲基化水平的初步分析
• 3.2 基因组三倍化对虾夷扇贝甲基化水平的影响
• 3.3 基因组三倍化对虾夷扇贝性别及性腺发育的影响——来自甲基化水平变异的解释
• 3.4 基因组三倍化对虾夷扇贝生长性状的影响
• 论文小结
• 参考文献
• 附表
• 博士在读期间完成的学术论文与科研获奖
• 致谢