Escherichia coli DH10B和Stenotrophomonas maltophilia R551-3共代谢吡虫啉及其硝基还原机制研究

论文摘要

本论文主要开展了大肠杆菌（Escherichia coli） DH10B共代谢烟碱类杀虫剂吡虫啉（IMI）及降解条件的优化研究；利用同源重组系统敲除E.coli DHIOB中与IMI硝基还原途径有关的基因；构建了嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）R551-3与IMI硝基还原途径相关基因的表达质粒并进行了异源表达。在克隆和表达S. maltophilia R551-3的IMI硝基还原酶过程中,发现以琥珀酸钠为共代谢物,E. coli DH10B的静息细胞可降解IMI,而以蔗糖为共代谢物则IMI不降解。质谱分析显示以琥珀酸钠为共代谢物,E. coli DH10B可将IMI （=N-NO2）代谢为urea IMI （=O）产物。论文进一步考察共代谢物以及培养条件对E. coli DH10B降解IMI的影响。与S. maltophilia CGMCC 1.1788和R551-3降解IMI相比,E.coli DH10B在酸性条件下几乎不降解IMI。通过转化条件优化,综合优化条件后,E. coli DH10B的urea IMI生成量和IMI降解量分别比优化前提高了92%和86%。论文进一步开展了E. coli DH10B中与IMI硝基还原途径相关的酶的敲除研究。钼蛋白抑制剂甲萘醌抑制IMI的降解和urea IMI生成,表明IMI的代谢与钼蛋白有关。生物信息学分析显示E. coli DHIOB蛋白组中与钼蛋白乙醛氧化酶相近的蛋白有YagR、XdhA和XdhD三个蛋白。采用pSC101-BAD-gbaA介导的同源重组对E.coli DHIOB的YagR、XdhA和XdhD基因进行敲除,用HPLC检测IMI的降解。实验结果显示,通过red同源重组系统成功地分别敲除了YagR和XdhA基因,IMI降解试验表明,敲除YagR后的E.coli DH10B菌株的IMI降解量和urea IMI生成量分别减少30%和22%,显然YagR基因敲除后可减弱IMI的降解和urea IMI生成。XdhA基因敲除菌株的IMI代谢与对照组相同,因而可排除XdhA蛋白是IMI的硝基还原酶的可能。XdhD基因的敲除正在继续开展。S. maltophilia是本实验室多年来一直用于研究IMI代谢的出发菌株。目前S.maltophilia R551-3的全基因组已公布。以琥珀酸为共代谢基质,该菌株可将IMI代谢为urea IMI、olefin IMI。在以蔗糖为共代谢基质,则抑制IMI的硝基还原途径。在该菌株的细胞质中添加琥珀酸可促进IMI的硝基还原,表明IMI的硝基还原酶是可溶性蛋白。参考有关文献以及公布的S. maltophilia R551-3菌株的全基因组,参与IMI硝基还原的酶可能是醌氧化还原酶（NQO）、羰基还原酶或乙醛氧化酶（AOX）,所以对S. maltophilia R551-3中这三类酶进行了表达质粒的构建及目的蛋白的表达。本实验成功构建了smal2429、2638、3642、1569、0358、0139和1991七个目的基因的pET-28a表达载体,可用于进一步研究IMI硝基还原酶的酶学特性等工作。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 一、烟碱类农药的概述
• 二、吡虫啉（IMI）的代谢研究进展
• 1、动植物代谢
• 2、微生物共代谢IMI及其共代谢途径
• 3、吡虫啉硝基还原酶的研究
• 三、嗜麦芽寡养单胞菌的研究简介
• 四、本实验的设计思路及方法
• 第二章 E.coli DH10B代谢IMI及其降解条件的优化研究
• 1. 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 相关试剂配制
• 1.1.4 主要仪器和设备来源
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种培养和保藏
• 1.2.2 摇瓶培养和转化方法
• 1.2.3 生物量的测定
• 1.2.4 HPLC分析
• 1.2.5 质谱分析
• 2. 实验结果
• 2.1 E.coli DH10B代谢IMI的HPLC分析
• 2.2 E.coli DH10B菌株静息转化IMI的降解曲线及urea IMI生成曲线
• 2.3 不同温度对IMI降解的影响
• 2.4 不同pH对IMI降解的影响
• 2.5 不同有机酸作为共代谢物对IMI降解的影响
• 2.6 不同溶氧量对IMI降解的影响
• 2.7 不同琥珀酸钠浓度对IMI降解的影响
• 2.8 E.coli DH10B代谢IMI及其降解条件的综合优化
• 3. 讨论
• 第三章 E.coli DH10B的IMI硝基还原酶基因敲除研究
• 1. 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 培养基的配制
• 1.1.3 相关试剂配制
• 1.1.4 工具酶及试剂盒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种培养和保藏
• 1.2.2 PCR
• 1.2.3 大肠杆菌E.coli DH10B/pSC101电转感受态细胞的制备
• 1.2.4 pSC101-BAD-ghaA介导的同源重组
• 1.2.5 敲除相应基因的E.coli DH10B静息细胞转化
• 1.2.6 HPLC活性检测
• 2. 实验结果
• 2.1 钼蛋白抑制剂甲萘醌对IMI代谢的抑制
• 2.2 YagR、XdhA和XdhD的生物信息学分析
• 2.3 同源臂PCR
• 2.4 验证片段PCR
• 2.5 E.coli DH10B△YagR菌株IMI硝基还原及IMI降解能力检测
• 2.6 E.coli DH10B△XdhA菌株IMI硝基还原及IMI降解能力检测
• 3. 讨论
• 第四章 S.maltophilia R551-3 IMI硝基还原酶的表达质粒的构建和蛋白表达
• 1、实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 培养基的配制
• 1.1.3 相关试剂配制
• 1.1.4 工具酶及试剂盒
• 1.1.5 主要仪器设备及来源
• 1.1.6 Marker分子量标准
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种培养和保藏
• 1.2.2 细菌基因组的提取
• 1.2.3 质粒提取（碱变性法）
• 1.2.4 试剂盒提取基因组和质粒
• 2感受态细胞的制备'>1.2.5 CaCl₂感受态细胞的制备
• 1.2.6 PCR
• 1.2.7 PCR产物纯化
• 1.2.8 DNA片段连接pMD18-T载体
• 1.2.9 DNA片段连接pET-28a表达载体
• 1.2.10 DNA片段双酶切及酶切片段回收
• 1.2.11 菌落PCR
• 1.2.12 TA连接产物化转入E.coli DH10B
• 1.2.13 表达质粒化转入E.coli BL21（DE3）
• 1.2.14 目的蛋白诱导表达
• 1.2.15 SDS-PAGE检测蛋白表达情况
• 2 实验结果
• 2.1 S.maltophilia R551-3基因组的提取
• 2.2 PCR扩增
• 2.3 目的片段连TA阳性克隆筛选
• 2.4 目的片段连pET-28a表达载体
• 2.5 S maltophilia R551-3 IMI硝基还原酶的诱导表达
• 3. 讨论
• 参考文献
• 本文的创新与不足之处
• 致谢