疫霉菌诱导的南瓜SSH文库构建及表达序列标签分析

论文摘要

南瓜是葫芦科南瓜属一年生经济作物,其经济价值和药用价值均十分显著。随着对外贸易的发展和南瓜籽及南瓜系列产品的开发,南瓜种植面积不断扩大,为农民带来了巨大的经济效益。在有的年份和地块由于南瓜疫病的流行,籽用南瓜的产区受疫病危害,引起的死秧、烂瓜现象严重,重症年份部分地区甚至绝产,因此,疫病已成为南瓜生产的限制因子,生产上迫切需要解决疫病危害的问题。然而,只有深入研究南瓜的抗病机制以及南瓜与病原菌的互作关系,才能从根本上解决这个问题。本研究运用抑制差减杂交（SSH）技术构建cDNA文库,应用EST技术并结合生物信息学技术,通过对南瓜抗疫病相关基因的表达分析,从基因水平来研究南瓜抗病机制。为今后的南瓜抗疫病遗传育种奠定理论基础。本试验构建了一个南瓜接种疫霉菌后6,12,24,36,48,72小时的混合SSHcDNA文库,通过反向Northern杂交、质粒双酶切、菌液PCR进行初步筛选后,对其中60个阳性克隆进行单向测序获得55个质量较好的EST序列。与GenBank数据库进行BLASTx和BLASTn比较分析,共有52条EST具有蛋白编码功能,占全部分析EST的94.5%,3条EST找不到任何同源序列,推测可能是一类新的基因,或变异度较高的cDNA非编码区。与52条EST同源的推测蛋白质序列来自黄瓜、西瓜、拟南芥、水稻、甘蓝型油菜、甘蓝、马铃薯、葡萄、玉米、烟草、高粱、甜菜、菜豆等多个物种。通过对获得的EST序列进行分析,推测钙调蛋白激酶、茉莉酸等信号传导系统可能参与了南瓜抗疫病防卫反应过程中的信号传导,但各信号传导间的相互作用机制还不清楚。抗病相关转录因子包括锌指蛋白、MYC转录因子、G-box结合蛋白,它们可能在南瓜抗病防卫反应基因的表达调控中起到重要作用。在本研究中,有两条EST与马铃薯和拟南芥的抗病基因类似物有部分同源性,应该是参与南瓜抗疫病反应的重要基因。另外在所获得的EST中存在部分非生物胁迫诱导蛋白如热休克蛋白、盐诱导蛋白等。说明生物机体对外界的胁迫反应,存在某种协同机制。在获得的EST中还包括一些RNA加工、蛋白翻译与加工、光合作用、能量代谢基因,说明这些基础功能基因也与南瓜抗病机制相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.1.1 病原及发病特点
• 1.1.2 疫霉菌的侵染过程及致病机理
• 1.2 植物抗病的分子机制
• 1.2.1 过敏性反应研究
• 1.2.2 系统获得性抗性
• 1.2.3 诱导系统抗性
• 1.2.4 植物抗病基因介导的信号途径
• 1.3 差减杂交技术及其应用
• 1.3.1 差减杂交技术
• 1.3.2 表达序列标签（ESTs）技术及其应用
• 1.3.3 生物信息学的应用
• 1.4 试验研究内容及技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 南瓜品种
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 化学试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 抗病材料筛选
• 2.2.2 抑制差减cDNA 文库构建
• 2.2.3 反向Northern 杂交初步筛选差异表达
• 3 结果与分析
• 3.1 抗源筛选
• 3.2 总RNA 提取结果
• 3.3 总RNA 浓度及纯度检测
• 3.4 MRNA 质量检测结果
• 3.5 抑制差减杂交检测结果
• 3.5.1 双链cDNA 合成
• 3.5.2 RsaI 酶切
• 3.5.3 接头连接效率检测
• 3.5.4 差减杂交后产物的两次PCR 扩增结果
• 3.5.5 差减效率检测
• 3.6 SSHCDNA 文库质量评价
• 3.6.1 蓝白斑筛选结果
• 3.6.2 文库插入片段大小鉴定
• 3.7 反向NORTHERN 杂交筛选结果
• 3.8 序列测定结果与分析
• 3.8.1 抗病反应信号传导
• 3.8.2 抗病基因介导的信号途径
• 3.8.3 防卫反应基因的表达调控
• 3.8.4 蛋白降解及水解酶类
• 3.8.5 抗病基因类似物
• 3.8.6 植物抗逆相关基因
• 3.8.7 其他相关基因
• 3.8.8 未知功能基因
• 4 讨论
• 4.1 RNA 提取及文库质量
• 4.2 SSH 技术用于抗病相关基因研究的优越性
• 4.3 南瓜接种疫霉菌初期参与抗病过程的相关基因
• 4.3.1 抗病基因类似物
• 4.3.2 抗病信号传导
• 4.3.3 防卫反应转录调控
• 4.3.4 其它相关基因
• 4.4 今后研究方向
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文