拉帕替尼联合顺铂对宫颈腺癌细胞的作用及其机制研究

论文摘要

研究背景和目的宫颈癌是我国常见的妇科恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌位居第二位,每年有3万患者死于宫颈癌。近20年来,随着宫颈癌发病率的增加,患者呈现年轻化趋势,其中宫颈腺癌所占比例也逐年升高,且与宫颈鳞癌比较,患者预后较差。宫颈腺癌由于多属于内生型、易于深浸宫颈间质、血管淋巴间隙,较早出现转移,这也是宫颈腺癌预后较差的原因。目前以手术、放疗、化疗为主的综合治疗,可治愈大多数早、中期宫颈癌患者,但对于复发转移的晚期宫颈癌患者并未取得满意的疗效。晚期宫颈癌患者一般行以化疗为主的姑息性治疗,顺铂被认为是治疗宫颈癌最有效的化疗药物,被举荐用于复发或远处转移宫颈癌的一线化疗,但肿瘤细胞容易对其产生耐药性。因此,进一步对宫颈癌进行研究,寻求新的治疗方法和药物显得非常重要。肿瘤分子靶向治疗是一种全新的生物治疗模式,其从分子水平阻断肿瘤恶性生物学行为,从而抑制肿瘤生长和转移,甚至使肿瘤消退。表皮生长因子受体（EGFR/HER）家族由四个糖蛋白组成,包括ErbB1 （EGFR）、ErbB2 （HER-2）、ErbB3 （HER-3）、ErbB4 （HER-4）。EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物,是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。它与肿瘤的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡抑制有关。研究表明EGFR可在宫颈癌患者中高表达,其表达提示预后不良。拉帕替尼（lapatinib, Tykerb）是一种喹唑啉胺类化合物,是口服的小分子EGFR/HER-2双受体酪氨酸激酶抑制剂,其化学名：二对苯基磺酸拉帕替尼单水合物（lapatinib ditosyla temonohydrate）。它通过抑制细胞内的EGFR （ErbB-1）和HER-2（ErbB-2）的ATP位点阻止肿瘤细胞磷酸化和激活,阻断EGFR （ErbB-1）和HER-2（ErbB-2）受体的下调信号,从而抑制肿瘤生长。拉帕替尼由英国葛兰素史克公司研发,2007年5月已被美国FDA批准与卡培他滨联合治疗ErbB-2过度表达,既往接受过蒽环类、紫杉醇、曲妥珠单抗（赫赛汀）治疗的晚期或转移性乳腺癌患者。拉帕替尼在宫颈癌方面已有一定的研究。ether a go-go钾通道（Eag1）是电压门控性钾通道Eag家族中的一个成员,该家族中的成员包括Eag（包括Eag1和Eag2）、Erg（包括3个成员）和Elk（包括2个成员）通道。人的Eag1基因的染色体位于1q 32.1-2,它是1969年Kaplan在对乙醚麻醉时出现腿震颤的黑腹果蝇作突变检测时发现的一个新的独立基因位点,属电压门控性钾通道,通过去极化而激活,对K+和Ca2+均有通透性。Eag1通道在大脑中表达丰富,但在外周正常组织的表达非常局限,研究发现在成肌细胞和胎盘可检测到其表达。Eag1在一些原代肿瘤细胞和肿瘤细胞系中可特异性地高表达,并与细胞的恶性转化、肿瘤增殖、转移和预后密切相关。因此,本课题选择拉帕替尼及顺铂联合作用于宫颈腺癌Hela细胞,通过研究两药物在宫颈癌的体外抑制作用,以及拉帕替尼对宫颈癌细胞周期、细胞凋亡、Eag1钾离子通道的影响,以探讨其可能作用机制,为宫颈癌的综合治疗、疗效的提高提供理论基础。第一章拉帕替尼联合顺铂（DDP）对Hela细胞体外生长的抑制作用,拉帕替尼对Hela细胞周期及凋亡的影响一、材料和方法1.Hela细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传一次代,选择对数生长期细胞作为实验用；2.用MTT法检测Hela细胞生长曲线：设置正常组和空白对照组,细胞种板过夜后检测OD值（490nm）,连续10天在同一时间检测,并用Excel绘制细胞生长曲线；3.宫颈癌Hela细胞EGFR、HER-2基因的表达：待细胞长满培养瓶80%后收集细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,逆转录成cDNA后采用一般PCR试剂盒于PCR扩增仪进行反应,扩增完成后行PCR产物凝胶电泳成像,在紫外灯下观察EGFR、HER-2基因表达情况。4.将细胞分成4组,分别为拉帕替尼单药组、DDP单药组、拉帕替尼联合DDP组、对照组。检测细胞增殖抑制率时拉帕替尼药物浓度分别为0.5、1、2、4、8、10,20μmol/L; DDP药物浓度分别0.75、1.5、3、6、12、24、48μg/ml,分别于加药后24h、48h、72h检测。拉帕替尼联合DDP组药物浓度是1μmol/L+0.75μg/ml、2μmol/L+1.5μg/ml、4μmol/L+3μg/ml,药物作用72h后检测。倒置显微镜观察,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡时,拉帕替尼药物浓度均为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L,药物作用72h后检测。5.采取上述分组,用MTT法检测药物对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制,根据OD值计算细胞生长抑制率。6.采用协同作用q值判断拉帕替尼和DDP联用的性质：q>1.15为协同作用,0.85≤q≤1.15为相加作用,q<0.85为拮抗作用。7.采取上述分组,收集细胞用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。8.统计处理：实验结果以均数±标准差（x±s）表示,数据处理采用SPSS 11.5统计软件,各组间细胞抑制率比较采用析因设计的方差分析；细胞周期及细胞凋亡率结果采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；多重比较采用LSD检验或Dunnett’ s T3检验。P≤0.05（双侧）表示有统计学差异。二、结果1.宫颈癌Hela细胞生长曲线：从生长曲线观察,种板后的Hela细胞第1～7天均呈指数生长,其中第4～7天生长最快,之后开始逐渐减慢。2.宫颈癌Hela细胞EGFR及HER-2的表达：通过PCR的定性检测,证明Hela细胞存在EGFR表达,而未见HER-2的表达。3.拉帕替尼联合DDP对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用经MTT法检测,不同浓度、不同时间拉帕替尼或DDP单药对人宫颈腺癌细胞均有抑制作用,并随着浓度的增高及时间的延长其抑制率显著增高（P均<0.05）。部分拉帕替尼和DDP联合组（1μmol/L+0.75μg/ml,4μmol/L+3μg/ml）较相应浓度拉帕替尼组抑制率显著增高（P<0.05）,但较DDP单药组抑制率无显著差异（P>0.05）。4μmol/L+3μg/ml联合用药组显示出相加作用（q=0.99）而1μmol/L+0.75μg/ml、2μmol/L+1.5μg/ml联合用药组表现为拮抗作用（q均<0.85）。4.拉帕替尼单药作用于Hela细胞后在倒置显微镜下的形态观察对照组细胞贴壁状态良好,呈多边形细胞,体积较大,胞浆丰满,细胞边界清楚。实验组细胞均有不同程度的形态变化,细胞变圆,体积缩小,但细胞膜结构完整。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。药物浓度为2.Oμmol/L,发生形态变化的细胞数量增多。高剂量组异常细胞更多见,细胞数量明显减少；5.拉帕替尼单药对人宫颈癌Hela细胞周期的影响对照组和1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L拉帕替尼组的G0/G1期、S期、G2/M期比率间有显著差异（P均<0.05）。G0/G1期随着浓度的增高其比率呈上升趋势,而G2/M期、S期则相反,呈下降趋势。6.拉帕替尼单药对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L拉帕替尼单药组能够显著诱导Hela细胞凋亡,且随给药剂量的增加,凋亡率增高,较对照组均有统计学差异（P<0.01）。第二章拉帕替尼对宫颈腺癌Hela细胞Eag-1钾离子通道表达的影响一、材料和方法1.Hela细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传一次代,选择对数生长期细胞作为实验用；2.实验分为对照组,拉帕替尼单药组（1、2、4 umol/L）,加药培养72h后提取RNA或全蛋白检测。3.逆转录实时荧光定量PCR及Western-blot检测Hela细胞Eagl基因的表达变化。4.统计方法：所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理。实验数据以均数±标准差（x±s）表示,数据统计采用单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较均采用LSD检验。取P<0.05（双侧）表示差异有统计学意义。三、结果与对照组相比,拉帕替尼用药组（1、2 umol/L）Eag1基因表达量显著下调（P<0.01）,而拉帕替尼4 umol/L用药组未检测到Eag1基因表达。结论EGFR基因在宫颈癌Hela细胞中表达,可以作为宫颈癌治疗靶点。拉帕替尼、DDP单药对宫颈癌Hela细胞均有抑制增殖作用,呈剂量和时间依赖性；两药联合高剂量组表现为相加作用。拉帕替尼单药作用Hela细胞后,细胞周期分析显示G0/G1期细胞较对照组显著增多,S、G2/M期细胞则较对照组显著减少。拉帕替尼能够诱导Hela细胞凋亡,并随给药剂量的增加,凋亡率显著增高。拉帕替尼作用Hela细胞后Eag1钾离子通道表达显著下调,认为拉帕替尼可能通过抑制Eag1钾离子通道,进而调控细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖,值得进一步深入研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 拉帕替尼联合顺铂（DDP）对宫颈腺癌Hela细胞体外生长的抑制作用,拉帕替尼对Hela细胞周期及凋亡的影响
• 1、材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 细胞株
• 1.4 主要仪器
• 2、实验方法
• 2.1 细胞培养基本技术
• 2.2 MTT方法检测细胞生长曲线
• 2.3 RT-PCR检测细胞EGFR及HER-2基因表达
• 2.4 MTT检测细胞抑制作用
• 2.5 倒置显微镜细胞形态观察
• 2.6 流式细胞术检测细胞周期
• 2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.8 统计分析
• 3、结果
• 3.1 生长曲线的绘制
• 3.2 RT-PCR检测细胞EGFR及HER-2基因表达
• 3.3 拉帕替尼及顺铂联合对Hela细胞的生长抑制作用
• 3.4 拉帕替尼对Hela细胞显微镜形态观察
• 3.5 拉帕替尼对Hela潮胞周期分布的影响
• 3.6 拉帕替尼对Hela细胞的凋亡诱导作用
• 4、讨论
• 第二章 拉帕替尼对宫颈腺癌Hela细胞Eag-1基因表达的影响
• 第一节 Real-time RT-PCR检测Eag1基因表达的变化
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、结果
• 第二节 拉帕替尼对Hela细胞Eag1蛋白表达的影响
• 1、材料
• 2、实验方法
• 3、结果
• 讨论
• 参考文献
• 英文缩略词
• 成果
• 致谢
• 统计学证明