肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶在慢性阻塞性肺疾病发病机制中的作用的研究

论文摘要

前言慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是引起全世界呼吸系疾病发病率和死亡率不断上升的重要原因。进行性的气流受限所致的肺功能下降是COPD患者特征性的临床表现,目前对COPD的药物治疗主要是缓解症状或减少并发症,而无有效的方法以阻止其肺功能进行性的下降。吸烟是引起COPD的最主要的危险因素;弹性物质的降解则COPD的特征性的病理表现。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases,MMPs）是一类高度保守的依赖于锌离子和钙离子的内切蛋白水解酶家族,能够降解弹性蛋白、蛋白聚糖、Ⅳ型胶原等细胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分。近年来研究发现中性粒细胞弹性蛋白酶在由先天性血清α1-AT（α1-antitrypsin,α1-AT）缺乏所致的COPD的发病中起着重要作用;而在吸烟相关的COPD中,肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AM）及MMPs的作用越来越引起人们关注。因此,本课题主要研究了香烟烟雾和TNF-α对AM源性MMPs表达的影响以及核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）介导的信号转导途径在MMPs表达中的作用,从而为COPD的防治提供新的策略。第一部分被动吸烟大鼠巨噬细胞源性基质金属蛋白酶的表达及N-乙酰半胱氨酸对之的影响分题一香烟烟雾提出物对大鼠肺泡巨噬细胞活性及基质金属蛋白酶9和组织基质金属蛋白酶抑制剂1平衡的影响目的:探讨烟雾对肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）表达的影响及其在慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病中的作用。方法:制备被动吸烟大鼠模型,从支气管肺泡灌洗液中分离与培养大鼠肺泡巨噬细胞（AM）;制备香烟烟雾提出物（CSM）,刺激培养的AM。以二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色（MTT）法检测CSM对AM活性的影响;以半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达。结果:CSM的浓度低于5%时,CSM对AM无显著的细胞毒性;当CSM浓度超过5%时,CSM对AM的细胞毒性显著增加。当CSM浓度低于5%,随着CSM浓度的增加,MMP-9、TIMP-1 mRNA表达相应增加;当CSM浓度高于5%时,MMP-9、TIMP-1 mRNA表达则相应下降,组间存在显著性差异（P<0.05）。以5%CSM刺激AM,在24h内,随着刺激时间的延长,MMP-9 mRNA的表达也相应增加,TIMP-1 mRNA的表达则先增加后下降,组间存在显著性差异（P<0.05）。结论:CSM能诱导AM源性MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达,并导致其平衡失调;CSM诱导的AM源性MMP-9和TIMP-1之间的平衡失调在吸烟相关的COPD发病中可能起着重要作用。分题二N-乙酰半胱氨酸对吸烟大鼠巨噬细胞源性明胶酶和巨噬细胞弹性蛋白酶表达的影响目的研究N-乙酰半胱氨酸（NAC）对香烟烟雾提出物诱导的吸烟大鼠肺泡巨噬细目的研究N-乙酰半胱氨酸（NAC）对香烟烟雾提出物诱导的吸烟大鼠肺泡巨噬细胞源性明胶酶、巨噬细胞弹性蛋白酶mRNA表达及明胶酶活性的影响。方法制备被动吸烟大鼠模型,从支气管肺泡灌洗液中分离与培养大鼠肺泡巨噬细胞（AM）;制备香烟烟雾提出物（CSM）,刺激培养的AM。以半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测明胶酶A（MMP-2）、明胶酶B（MMP-9）及巨噬细胞弹性蛋白酶（MMP-12）mRNA的表达;以明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性水平。结果在一定范围内,随着CSM刺激浓度的增加MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA表达相应显著增加（P<0.05）;但当CSM浓度过高时,MMP-2、MMP-9、MMP-12mRNA表达则下降（P<0.05）。当以5%CSM刺激AM时,在24 h内,随着刺激时间的延长,MMP-9、MMP-12 mRNA的表达也相应增加,MMP-2 mRNA的表达则先增加后下降（P<0.05）。未用CSM刺激前,MMP-2、MMP-9酶活性水平均较低,而当以CSM刺激后,MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA水平则显著升高,以MMP-9更明显。NAC能显著抑制CSM诱导的AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA的表达（P<0.05）,且MMP-2、MMP-9酶活性也随NAC剂量增加而降低,NAC剂量愈高,AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12 mRNA表达水平愈低。结论NAC在一定程度上可以抑制CSM诱导的AM源性MMP-2、MMP-9、MMP-12mRNA的表达,且使明胶酶活性水平相应降低。第二部分TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达的信号转导途径的研究分题一核因子κB在TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达中的作用目的探讨核因子KB（NF-κB）介导的信号转导在TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞（AM）源性基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达中的作用。方法从慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者或健康志愿者支气管肺泡灌洗液中分离与培养AM,以吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）或N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理1.5h,接着再以TNF-α刺激24 h。以半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测MMP-9、MMP-2、TIMP-1 mRNA表达;以明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9酶活性水平;以Western blotting检测MMP-9蛋白的表达;以凝胶阻滞分析实验（EMSA）检测NF-κB活性。结果以TNF-α刺激健康志愿者及COPD患者AM后, MMP-9和MMP-2 mRNA表达水平及明胶酶活性均随着TNF-α刺激剂量的增加而相应增加（P<0.05）,而TIMP-1 mRNA的表达则随着TNF-α刺激剂量的先增加而后出现降低;且COPD患者的MMP-9、MMP-2、TIMP-1 mRNA水平及明胶酶活性较健康志愿者增加更为显著。而若以PDTC或NAC预处理AM 1.5 h,再以TNF-α刺激,TNF-α诱导的COPD患者AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表达则随着PDTC或NAC剂量的增加而显著性下降,组间差异存在显著性（P<0.05）。以TNF-α刺激离体培养的COPD患者AM时,NF-κB的活性显著增加（P<0.05）;PDTC和NAC则能显著抑制TNF-α刺激引起的NF-κB的活化（P<0.05）。结论TNF-α能上调AM源性MMP-9、MMP-2和TIMP-1 mRNA的表达;PDTC和NAC则能抑制TNF-α刺激诱导的AM源性MMP-9 mRNA和蛋白的表达;NF-κB介导的信号转导在TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达中起着重要作用。分题二吡咯烷二硫代氨基甲酸盐和N-乙酰半胱氨酸抑制核因子κB活化的作用机理研究目的研究吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）或N-乙酰半胱氨酸（NAC）对TNF-α或IL-1诱导的IKKα、IKKp和IκBα的磷酸化及NF-κB活化的影响,从而探讨PDTC和NAC抑制NF-κB活化的药学机理。方法从慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者支气管肺泡灌洗液中分离与培养肺泡巨噬细胞（AM）,以PDTC或NAC和AM共孵育1.5 h,接着以TNF-a或IL-1刺激90 min。以Western blotting检测IKKa、IKKβ和IκBα自磷酸化水平;以凝胶阻滞分析实验（EMSA）检测NF-κB的活化水平。结果NAC能显著抑制由TNF-α诱导的IKKα、IKKβ和IKBα的磷酸化（P<0.05）,而对IL-1诱导的IKKα、IKKβ和IκBα的磷酸化则没有显著的抑制作用（P>0.05）。PDTC对TNF-α或IL-1诱导的IκBα的磷酸化均无显著的抑制作用（P>0.05）。NAC能显著抑制由TNF-α诱导的NF-κB的活化（P<0.05）,而对IL-1诱导的NF-κB的活化则没有显著的抑制作用（P>0.05）;而PDTC则对TNF-α或IL-1诱导的NF-κB的活化均有显著的抑制作用（P<0.05）。PDTC和NAC均不能在体外直接抑制NF-κB的DNA结合活性（P>0.05）。结论NAC能抑制引起IKK活化的上游,从而阻断TNF-α刺激的NF-κB的活化过程;PDTC则通过抑制IκBα的降解、阻止IκB和NF-κB复合体的解离,从而抑制NF-κB的活化。NAC和PDTC作为NF-κB活化的抑制剂,与其抗氧化特性无直接关系。第三部分核酸锁修饰的核因子KB诱捕寡核甘酸对肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达的影响目的研究核酸锁（LNA）修饰的NF-κB诱捕寡核甘酸（ODNs）对TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者肺泡巨噬细胞（AM）源性MMP-9、MMP-2表达以及NF-κB活性的影响。方法从COPD患者支气管肺泡灌洗液中分离与培养AM,脂质体转染NF-κB诱捕（decoy）ODNs和NF-κB错配ODNs,接着以TNF-α刺激AM。以半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测MMP-9、MMP-2 mRNA的表达;以Western blotting检测MMP-9蛋白的表达;以凝胶阻滞分析实验（EMSA）检测NF-κB活性。结果NF-κB decoy ODNs显著抑制TNF-α诱导的AM源性MMP-9、MMP-2 mRNA及MMP-9蛋白的表达（P<0.05）;错配ODNs则对TNF-α诱导的AM源性MMP-9、MMP-2 mRNA以及MMP-9蛋白的表达无显著影响（P>0.05）。NF-κB decoy ODNs显著降低TNF-α刺激所致的NF-κB活性水平（P<0.05）,而错配ODNs则对TNF-α刺激所致的NF-κB活性水平无显著影响（P>0.05）。结论LNA修饰的NF-κB decoy ODNs能够抑制TNF-α诱导的AM源性MMP-9的表达;LNA修饰和decoy ODNs为COPD的治疗提供了新的思路。

论文目录

• 英文缩略语表
• 论文摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一部分 被动吸烟大鼠巨噬细胞源性基质金属蛋白酶的表达及N-乙酰半胱氨酸对之的影响
• 分题一 香烟烟雾提出物对大鼠肺泡巨噬细胞活性及基质金属蛋白酶9和组织基质金属蛋白酶抑制剂1平衡的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 分题二 N-乙酰半胱氨酸对吸烟大鼠巨噬细胞源性明胶酶和巨噬细胞弹性蛋白酶表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达的信号转导途径的研究
• 分题一 核因子κB在TNF-α诱导的慢性阻塞性肺疾病患者肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分分题一的附图
• 分题二 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐和N-乙酰半胱氨酸抑制核因子κB活化的作用机理研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分分题二的附图
• 第三部分 核酸锁修饰的核因子κB诱捕寡核甘酸对肺泡巨噬细胞源性基质金属蛋白酶9表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分的附图
• 综述 基质金属蛋白酶的结构、调控及其与慢性阻塞性肺疾病的关系
• 致谢