红树林沉积物细菌多样性分析及其功能基因筛选

论文摘要

红树林是自然分布于热带、亚热带海岸的潮间带的木本植物群落,通常生长在港湾河口地区的淤泥质滩涂上,是海滩上特有的森林类型。红树林沉积物具有强还原性、强酸性、高含盐量、营养丰富等特征,其微生物资源既丰富又不失特色。然而,至今对树林的研究绝大多集中在植物学、生态学、造林学等领域,在微生物学领域的研究甚少。研究红树林沉积物的微生物组成及其活性物质、功能基因的筛选有重大理论实践意义。本论文以福建龙海浮宫红树林沉积物样品为研究对象,采用宏基因组技术,克服土壤中绝大部分微生物不可培养的弊端,通过16SrDNA文库的构建,分析了浮宫红树林沉积物中细菌的多样性和结构组成;并且,以pUC19为载体构建了3-10kb小片段宏基因组文库,筛选有纤维素酶活性的功能基因。获得的主要结果如下:1.构建了红树林沉积物的16SrDNA文库,研究其细菌群落组成。RFLP分型表明文库中存在丰富的细菌多样性,有30种优势菌。对30种优势菌的16SrDNA序列测序结果表明:优势菌中变形细菌纲（Proteobacteria）占优势（70.0%）。其中,α-Proteobacteria占3.3%;γ-Proteobacteria占26.7%;δ-Proteobacteria占10.0%;ε-Proteobacteria占30.0%。除了变形菌外,还检测到未可培养,性质以及分类尚不清楚的细菌,占20 %;浮霉菌纲（Planctomycetacia）、Bacteroidetes（拟杆菌门）和疣微菌门（Verrucomicrobia）,分别占3.3%。2.以红树林沉积物样品为材料,以pUC19质粒为载体,DH5α为宿主菌构建了3-10Kb小片段宏基因组文库pUC19-Hsediment。文库含有45000个克隆子,平均插入片段为5.4kb,包含了约450Mb的沉积物样品DNA。3.从该文库筛选到3个含有不同插入片段（6.4kb、2.6kb、1.2kb）的具有胞外纤维素酶活性的克隆子。对克隆子插入序列的分析工作正在进行当中。上述结果揭示了红树林沉积物中蕴藏着丰富的新微生物资源。宏基因组技术在环境微生物资源的开发上是个有力工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 红树林区微生物资源概况
• 1.1.1 红树林区的特点
• 1.1.2 红树林区微生物资源研究进展
• 1.1.3 红树林沉积物微生物纤维素酶酶系研究
• 1.2 环境微生物宏基因组研究
• 1.2.1 宏基因组概念的提出
• 1.2.2 宏基因组技术的原理及其要素
• 1.2.2.1 环境总DNA 的提取及其纯化
• 1.2.2.2 载体的选择
• 1.2.2.3 宿主的选择
• 1.2.2.4 宏基因组文库的分析
• 1.3 宏基因组技术的应用
• 1.3.1 细菌的多样性研究
• 1.3.1.1 细菌多样性分析的分子生物学进展
• 1.3.1.2 宏基因组技术在细菌多样性分析中的应用
• 1.3.2 利用宏基因组技术寻求生物活性物质的表达
• 1.3.2.1 宏基因组技术在生物活性筛选中的应用优势
• 1.3.2.2 宏基因组技术在生物活性筛选中的应用实例
• 1.3.2.3 利用宏基因组技术克隆纤维素酶基因
• 1.4 论文研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 主要培养基
• 2.1.7 溶液配制
• 2.1.8 序列分析软件
• 2.2 基本方法
• 2.2.1 红树林沉积物1651DNA 文库的构建
• 2.2.1.1 沉积物基因组 DNA 提取
• 2.2.1.2 基因组 DNA 大片段的纯化
• 2.2.1.3 16S rDNA 基因片段的PCR 扩增
• 2.2.1.4 PCR 产物纯化
• 2.2.1.5 PCR 产物与T-vector 连接
• 2.2.1.6 感受态细胞的制备
• 2 法'>2.2.1.6.1 CaCl₂法
• 2.2.1.6.2 Inoque 法
• 2.2.1.6.3 转化率的测定
• 2.2.1.7 转化
• 2.2.1.8 文库保存
• 2.2.1.9 文库中阳性克隆子筛选及RFLP 分析
• 2.2.2 红树林沉积物宏基因组文库的构建
• 2.2.2.1 环境总DNA 提取
• 2.2.2.2 总DNA 不完全酶切
• 2.2.2.4 DNA 定量
• 2.2.2.5 质粒pUC19 的提取
• 2.2.2.6 质粒酶切
• 2.2.2.7 线性质粒DNA 回收
• 2.2.2.8 线性质粒DNA 去磷酸化
• 2.2.2.9 载体与目的DNA 连接
• 2.2.2.10 感受态细胞制备及转化
• 2.2.2.11 宏基因组文库的保存和评估
• 2.2.3 产纤维素酶克隆子的筛选及其分析
• 2.2.3.1 产纤维素酶克隆子的筛选
• 2.2.3.2 产纤维素酶克隆子的酶活鉴定
• 2.2.3.3 产纤维素酶克隆子插入片段的分析
• 3 结果与分析
• 3.1 红树林沉积物细菌1651DNA 文库的构建
• 3.1.1 沉积物总DNA 的提取和纯化
• 3.1.2 16SrDNA 的扩增
• 3.1.3 16SrDNA 的连接和转化
• 3.1.4 16SrDNA 文库阳性克隆子筛选及RFLP 分析
• 3.1.5 红树林沉积物细菌多样性分析
• 3.2 红树林沉积物宏基因组文库（3-10kb）的构建
• 3.2.1 总DNA 的提取及其纯化
• 3.2.2 总DNA 的不完全酶切及其3－10k 片段的回收纯化
• 3.2.3 连接载体pUC19 的准备
• 3.2.4 载体与目的DNA 的连接与转化
• 3.2.5 宏基因组文库的构建
• 3.2.6 宏基因组文库的评估
• 3.3 红树林宏基因组文库中产纤维素酶基因的筛选
• 3.3.1 产纤维素酶克隆子的获得
• 3.3.2 产纤维素酶克隆子的酶活鉴定
• 3.3.3 产纤维素酶克隆子的插入片段分析
• 4 讨论
• 4.1 红树林沉积物微生物资源的开发
• 4.2 红树林沉积物细菌1651DNA 文库的构建与分析
• 4.2.1 沉积物细菌 16SrDNA 文库的构建
• 4.2.2 红树林沉积物优势细菌组成分析
• 4.3 红树林沉积物宏基因组文库（3-10kb）构建及其活性筛选
• 4.3.1 宏基因组文库的构建
• 4.3.2 红树林沉积物宏基因组文库的活性物质筛选
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢