上海地区猪戊型肝炎分子流行病学调查

论文摘要

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）属于人畜共患病,是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起,该病对人类健康具有很大的危害。HEV在动物宿主中以猪的感染率最高,病毒载量最大,而且从中分离到的病毒和人源毒株也有较高的同源性。因此,摸清猪群中该病的存在状况,对防控人戊型肝炎的发生具有重要的公共卫生学意义。本试验采用RT-nPCR的方法,对上海地区猪群粪便中的戊型肝炎病毒RNA进行了检测,并通过测序和系统进化分析,探明了上海地区猪场中戊型肝炎病毒的存在情况,该研究结果为有效防制戊型肝炎发生提供了科学依据。试验分为两部分:1.基因3型猪戊型肝炎病毒的分离鉴定本试验从上海地区几个猪场中随机采集了46份粪便样品,制备成10%的粪便稀释液,提取总RNA,应用特异性兼并引物进行RT-PCR,反转录得到的cDNA产物,通过四条兼并引物进行nested-PCR操作,扩增HEV基因组目的片断,琼脂糖凝胶电泳进行检测,电泳检测的阳性样品扩大体系扩增目的片断,克隆到pMD19-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,然后进行蓝白斑筛选,挑选鉴定阳性克隆,进行测序。序列通过CLUSTAL-W （version 1.8）、Mega （version 3.1）和Lasergene（version 7.0;DNAstar）等生物学软件进行比对、遗传距离计算、N-J法进化树构建,从而确定病毒的进化地位。结果表明,46个样品中的12份为阳性,测序和进化分析发现,有两株戊型肝炎病毒为基因3型,分别命名为CSH-3和CSH-4。为了进一步研究这两株病毒的特性,对基因组另一个片断进行了扩增,同样鉴定为基因3型。这是中国大陆首次发现基因3型戊型肝炎病毒。2.上海地区猪戊型肝炎的分子流行病学调查为了能够准确的了解上海地区戊型肝炎在猪群中的流行情况,从上海市10个辖区的37个猪场中检测了426份粪便样品。通过RT-nPCR的方法,扩增HEV ORF2的部分片断,再通过测序和系统进化分析。结果表明,426份样品中有111份为HEV阳性,各个区的阳性率均在0.0%～41.7之间。从每个猪场阳性样品中随机挑选12个扩大体系扩增,将扩增的片断克隆T载体,进行测序。系统进化分析表明,其中的10株属于基因4型,而且和从上海地区人体内分离到的两株戊肝病毒有很高的同源性。其余的22株属于基因3型,在进化树中,形成一个新的分支,但是和一株美国分离到的猪戊型肝炎病毒有较高的同源性。该研究结果证明基因3型HEV在上海分布已较为广泛,但在前期国内的研究结果显示,中国境内猪群中只存在基因4型,因而对基因3型HEV来源还有待进一步研究。

论文目录

• 中英文缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1. 病毒分类
• 2. 病毒生化特性
• 3. 宿主嗜性与病毒感染
• 4. 病毒的培养
• 5. 病毒生物学性质：病毒基因组
• 6. 遗传异质性
• 7. 病毒编码蛋白
• 8. 病毒的复制
• 9. 病毒的流行模式和分布情况
• 10. 病毒的传播和存在模式
• 11. 疾病临床症状和免疫应答
• 12. 发病机理
• 13. 疾病的诊断
• 14. 疾病预防和疫苗研制
• 试验一 基因3 型猪戊型肝炎病毒的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 检测样品
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 粪便样品的处理
• 1.2.2 RNA 提取相关用品
• 1.2.3 粪便 RNA 的提取
• 1.2.4 引物扩增效率
• 1.2.5 RT-PCR 及基因克隆
• 1.2.6 重组质粒 T 载体的构建及鉴定
• 2 结果
• 2.1 样品的检测结果
• 2.2 引物扩增效率
• 2.3 系统进化分析
• 3 讨论
• 试验二 上海地区猪戊型肝炎的流行病学调查
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 检测样品
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 试剂仪器等
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 上海地区戊型肝炎在猪场中的流行情况
• 2.2 系统进化分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读学位期间发表论文情况
• 附录