论文摘要
在现代社会里,由于工业与交通的快速发展,急性中枢神经系统损伤的发生率几乎呈直线上升;然而一方面虽然现代科学技术日益发展,高精尖设备业已应用于临床医学的诊断与治疗,但另一方面不可否认的是中枢神经系统损伤的致残率与死亡率却始终居高不下。面对这一棘手而现实的矛盾,世界各国均投入大量的人力、财力来研究中枢神经系统损伤后的修复这一神经科学的重大难题,其间干细胞（Stem cells）的发现和研究给这类疾病带来了希望的曙光,但目前关于干细胞的研究还主要停留在实验室阶段,而干细胞在神经系统疾病临床应用领域的研究则甚少,仅有关于神经退行性变的研究暂时处于领先地位,例如胚胎干细胞治疗帕金森病的研究工作也已经进入临床阶段。我们知道,中枢神经损伤后,由于神经细胞死亡、神经突触连接断裂以及神经细胞凋亡的发生,加上内源性的修复系统倾向于形成胶质细胞瘢痕修复,因此难以形成有效的神经功能修复从而影响疾病的预后。虽然干细胞治疗神经损伤已经成为一种趋势,但是由于多种原因目前这方面的工作进展还是比较缓慢,比如取材困难和伦理问题都限制着对干细胞的研究。然而近年来,脂肪干细胞（Adiposetissue-derived stem cells,ADSCs）已逐渐成为干细胞研究的一个新的趋向,因为这种干细胞来源于成脂细胞,具有取材容易,并可以向脂肪、骨、软骨、平滑肌、心肌、内皮、肝脏以及神经等多种组织分化的优点,因此为干细胞的研究和应用打开了一扇大门,本实验就是建立在观察移植脂肪干细胞治疗脑冷冻损伤前后相关指标变化的基础上,希望能为脂肪干细胞在神经系统损伤治疗领域中的应用奠定基础。本实验的内容包括:体外提取培养和纯化ADSCs,检测ADSCs的相关分子标记物,观察ADSCs的分化能力,并诱导其向神经元的方向分化。另外还要制作实验大鼠的脑冷冻伤模型,最后观察移植ADSCs后其对冷冻伤脑组织的保护情况以及对细胞凋亡的抑制情况和对损伤后神经功能障碍带来的改善并且研究这些过程形成的原因。本次实验分为两部分:—ADSCs的培养以及向神经元方向的定向分化目的:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞（ADSCs）,体外培养观察其形态、生长方式以及表面标志物表达等生物学特征。诱导ADSCs向神经细胞方向分化,观察其形态学特征和特异标志物的表达。方法:无菌条件下取SD大鼠的腹股沟和腹膜后脂肪,用机械分离和胶原酶消化结合的方法分离出ADSCs,并接种于15%FBSDMEM low Glucose培基中。进行纯化和传代,相差显微镜下动态观察细胞的形态。取第五代细胞进行流式细胞技术检测抗原标志物CD29、CD34、CD44。通过两步诱导法诱导ADSCs向神经细胞方向分化,免疫荧光法检测NSE、GFAP抗原的表达情况。低温冻存脂肪干细胞,并复苏传代。结果:从大鼠的脂肪组织中可分离培养ADSCs,呈贴壁式生长,贴壁速度快,为梭形细胞形态,在含血清培养中能够连续传代并稳定增殖。流式细胞技术检测显示这种脂肪来源的细胞CD34表达为阴性,CD29和CD44表达率在90%以上。经含bFGF和β—巯基乙醇的培养基联合诱导后,ADSCs可分化为强烈表达NSE的神经元样细胞,而未见星形胶质细胞特异表面标志GFAP的表达。冻存和复苏后的ADSCs仍然能稳定传代并被诱导向神经元方向分化。结论:1.大鼠的脂肪组织类可以分离出具有强大的体外扩增能力的细胞,这类细胞表达CD44、CD29等间充质干细胞的表面标志。2.脂肪来源的干细胞可以稳定的传代,经过神经方向诱导技术的诱导,这类细胞可以分化为表达NSE抗原的神经元样细胞。3.脂肪干细胞可以被冻存和复苏,复苏后细胞仍然可以稳定传代。二脂肪干细胞移植治疗脑冷冻伤动物模型目的:观察脂肪干细胞移植进入脑冻伤大鼠脑内后对动物的影响,研究脂肪干细胞移植做为一种新的手段治疗神经系统疾病的可行性。方法:体外培养并传代纯化的SD大鼠脂肪干细胞（ADSCs）,用BrdU标记过夜备用。用液氮硬膜外冷冻法制作大鼠的脑冷冻伤模型,将大鼠分为实验组（脑冷冻伤后12,14小时脑内移植Brdu标记的ADSCs）动物数量25只,对照组（脑冷冻伤后12,24小时移植DMEM培基）动物数量25和假手术组（仅行颅骨开窗手术）动物数量5只。分别在移植细胞后1,3,7,14,30天各个时间点对实验动物进行NSS神经功能评分,处死实验大鼠,制作脑组织切片,行免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞。行Tunel染色检测凋亡细胞,脑组织RT-PCR检测VEGF、BDNF等因子mRNA表达,Western blot检测VEGF、BDNF蛋白的表达。统计学方法采用单因素方差分析,统计学软件采用SPSS11.0软件包完成。结果:在移植了ADSCs后,免疫荧光学方法可以检测到Brdu标记的ADSCs在实验组大鼠脑组织内分布并且向病灶中心位置迁移,并且可以检测到Brdu和Nse双标阳性的细胞。实验组大鼠在3,7天两时间点同对照组相比NSS评分有显著差异（P＜0.05）。RT-PCR检测结果显示实验组大鼠脑组织中BDNF表达在1-14天表达比对照组更高（P＜0.05）而VEGF表达实验组在所有时间点都高于对照组（P＜0.05）,Western blot检测实验组的BDNF蛋白水平在1—14天与对照组相比明显的升高（P＜0.05）而VEGF蛋白在所有时间点都表达升高,并且通过Tunel凋亡检测发现移植ADSCs后所有时间点实验组大鼠脑组织中凋亡细胞比对照组明显减少（P＜0.05）。结论:1.成功制作大鼠脑冷冻伤动物模型,模拟了脑水肿和继发性脑损伤。2.脂肪干细胞可以在中枢神经系统中存活,迁移并分化为神经元样细胞3.它可以引起VEGF、BDNF等因子的高表达从而减少细胞凋亡,加速神经功能修复过程并达到保护脑组织的目的4.移植脂肪干细胞可以引起实验动物神经功能的改善。