根瘤菌内源质粒的属间转移及多样性的研究

论文摘要

本研究采用Tn5-mob-sacB转座子对含有三个内源质粒的华癸中生根瘤菌2020和含有两个内源质粒的华癸中生根瘤菌7653R进行质粒标记,获得2020和7653R的质粒标记菌株。利用sacB基因对蔗糖的敏感性进行标记质粒的消除,获得2020和7653R的质粒消除突变株2020D29,2020D8和7653RD。其中2020D29为2020的第一大质粒p2020c消除的突变株,2020D8为第二大质粒p2020b消除的突变株,7653RD是7653R共生质粒被消除的突变株,2020的第三大质粒p2020a和7653R的第二大质粒7653Ra很难被消除,原因可能是这两个质粒上含有菌株生长所必需的基因。对2020及其质粒缺失突变株共生固氮能力的研究结果表明:2020第一大质粒p2020c的消除可显著增强突变株2020D29的共生固氮效率,第二大质粒p2020b的消除则使突变株2020D8失去结瘤能力。将豌豆根瘤菌T83K3的共生质粒pJB5JI转入华癸中生根瘤菌2020和7653R及它们的质粒缺失突变株2020D29、2020D8和7653RD中。得到转移接合子2020-137,2020D8-8,2020-122,2020D29-13,2020D8-80,7653R-197,7653RD35,7653R-15,7653R5。其中2020-137和2020D8-8及7653R-197和7653RD35中的外源质粒的大小与pJB5JI一样,其它几个转移接合子中的外源质粒小于pJB5JI。将出发菌株和所得到的转移接合子进行共生效率和竞争结瘤实验的测定,结果表明:2020-137和7653R-197的竞争结瘤能力和固氮能力显著高于2020和7653R,而且对于不含共生质粒的受体菌2020D8和7653RD,pJB5JI也不能恢复它们在紫云英上结瘤的能力,说明豌豆根瘤菌的共生质粒与供试根瘤菌的共生质粒的功能不能互补。转移接合子2020D8-8和7653RD35可以在豌豆上结白色的无效瘤,而含有内源共生质粒的接合子却不能结瘤,表明华癸中生根瘤菌的共生质粒可能抑制pJB5JI功能的表达,后者可以在没有共生质粒的华癸中生根瘤菌的染色体背景下表达其结瘤功能,但固氮能力的表达可能还需要豌豆根瘤菌中其它基因的协同作用。对pJB5JI在受体中的稳定性进行检测,结果表明:pJB5JI可以在受体菌中稳定传代,但经过与紫云英共生之后却只能在部分根瘤分离物中检测到pJB5JI。对供试转移接合子和出发菌株及分离株进行Km基因的PCR扩增,发现除出发受体菌外,其余菌株都可以得到PCR产物,由此推断,在没有检测到pJB5JI的分离株中,pJB5JI可能部分或全部整合到了受体根瘤菌的染色体DNA中。费氏中华根瘤菌HN01含有三个内源质粒,其中第二大质粒是HN01的共生质粒,HND29是缺失了共生质粒的突变株,HND28是缺失了第三大质粒的突变株,HND100是同时缺失了第二和第三大质粒的突变株。同时将pJB5JI转入HN01和三个质粒缺失突变株中,获得转移接合子HN01-35,HN01-92,HND29-5,HND29-6,HND28-30,HND28-43,HND28-66,HND100-123等8个转移接合子,其中HN01-92,HND29-6,HND28-30和HND100-123中的外源质粒与pJB5JI的大小一样,HN01-35,HND29-5和HND28-43中的外源质粒小于pJB5JI,而HND28-66中有两个外源质粒,其中一个大小与pJB5JI一样,另一个与T83K3中最小质粒的大小相当,这说明,pJB5JI在转移时带动了另一个内源质粒的转移。同时将出发菌株和所得到的转移接合子进行共生效率和竞争结瘤实验的测定,结果表明:HN01-92和HND28-30的共生固氮能力和竞争结瘤能力与HN01和HND28相比没有明显变化,这与pJB5JI在华癸中生根瘤菌中的情况不同,说明根瘤菌的共生固氮效率和竞争结瘤能力与外源质粒和菌株本身的染色体基因都有关系;所有的转移接合子都不能在豌豆上结瘤,表明豌豆根瘤菌的其生质粒不能在费氏中华根瘤菌的遗传背景下表达。对pJB5JI在受体中的稳定性进行检测,结果表明:pJB5JI可以在受体菌中稳定传代,并且在经过与大豆共生之后,从接合子所结的根瘤中均检测到外源质粒,说明外源质粒在费氏中华根瘤菌中无论是人工传代还是与植物共生,都能稳定存在。利用16S rRNA PCR-RFLP、16S rRNA基因全序列分析以及16S-23S rRNA IGSPCR-RFLP技术对分离自我国江苏盐城,浙江温州,湖北仙桃及重庆等亚热带地区的42株豌豆根瘤菌进行了遗传多样性的研究。16S rRNA PCR-RFLP分析以及16SrRNA基因序列分析结果表明:所有供试豌豆根瘤菌可分为两个类群,类群1包括XtP1在内的40株豌豆根瘤菌和R.leguminosarum USDA2370,为优势种群,占供试菌株的97%,类群2由WzP3和WzP15组成,与R.etli CFN42相近。16S-23S rRNAIGS PCR-RFLP研究结果表明:所有供试菌株分为18个基因型,在91%的相似性上分为四个类群。其中群Ⅰ与R.leguminosarum USDA2370聚在一起。群Ⅱ包括菌株YcP2,YcP3和CqP7等三个菌株。群Ⅲ的菌株分布较广,占供试菌株的优势。群Ⅳ由WzP3和WzP15两个菌株及R.etli CFN42组成。RAPD将供试菌株分为9个群,其中类群Ⅳ仅包括菌株YcP2,群Ⅴ和Ⅸ分别来自温州和仙桃。该结果表明,供试菌株的分类具有明显的地域特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 根瘤菌和豆科植物共生关系的形成
• 1.1.1 根瘤菌中参与共生关系的基因
• 1.1.1.1 根瘤菌的结瘤基因
• 1.1.1.2 根瘤菌的固氮基因
• 1.1.1.3 共生基因的表达调控
• 1.1.2 结瘤因子
• 1.1.3 豆科植物中参与共生关系的基因
• 1.2 根瘤菌的质粒
• 1.2.1 共生质粒及其功能
• 1.2.2 非共生质粒及其功能
• 1.2.3 根瘤菌质粒的多样性和稳定性
• 1.2.4 根瘤菌质粒的不相容性
• 1.2.5 根瘤菌质粒的消除方法
• 1.2.6 根瘤菌质粒的转移
• 1.3 根瘤菌多样性的研究
• 1.3.1 表型多样性研究
• 1.3.1.1 多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）
• 1.3.1.2 全细胞可溶性蛋白电泳
• 1.3.1.3 全细胞脂肪酸分析
• 1.3.1.4 脂多糖分析（LPS）
• 1.3.1.5 数值分类法
• 1.3.2 遗传多样性研究
• 1.3.2.1 16S rRNA基因PCR-RFLP及其序列分析
• 1.3.2.2 16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP
• 1.3.2.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.3.2.4 随机引物扩增DNA片断多态性（RAPD）
• 1.3.2.5 基因组短重复序列的多态性分析
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试的菌株和质粒
• 2.1.2 供试植株品种
• 2.1.3 供试引物
• 2.1.4 培养基与培养条件
• 2.1.4.1 培养基
• 2.1.4.2 培养条件
• 2.1.5 抗生素与使用浓度
• 2.1.6 缓冲液与试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 根瘤菌的分离和纯化
• 2.2.2 菌株回接与有效性试验
• 2.2.3 根瘤菌质粒的快速检测
• 2.2.4 带有Tn5-mob-sacB的根瘤菌转座突变株的筛选
• 2.2.5 质粒上带有Tn5-mob-sacB标记菌株的筛选与标记质粒的消除
• 2.2.6 共生质粒的接合转移
• 2.2.7 根瘤菌质粒稳定性的检测
• 2.2.8 植物盆栽结瘤实验
• 2.2.9 竞争结瘤实验
• 2.2.10 根瘤固氮酶活测定
• 2.2.11 总DNA的提取
• 2.2.12 质粒DNA制备（常规碱变性法）
• 2.2.13 16S rRNA基因PCR-RELP
• 2.2.14 16S rRNA基因全序列分析
• 2.2.15 16S-23S rRNA IGS PCR-RELP
• 2.2.16 随机引物扩增DNA片段多态性分析（RAPD）
• 2.2.17 统计方法
• 3.结果和讨论
• 3.1 豌豆根瘤菌共生质粒与华癸中生根瘤菌2020的相互作用
• 3.1.1 华癸中生根瘤菌2020质粒的消除
• 3.1.1.1 华癸中生根瘤菌2020质粒稳定性的测定
• 3.1.1.2 三亲本杂交抗性标记的选择
• 3.1.1.3 质粒上带有Tn5-mob-SacB标记菌株的筛选
• 3.1.1.4 转座突变株标记质粒的消除与缺失突变株的筛选
• 3.1.1.5 2020及其突变株的共生固氮特性
• 3.1.1.6 小结与讨论
• 3.1.2 豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI向M.huakuii 2020及其质粒缺失突变株的转移
• 3.1.2.1 转移接合子的鉴定
• 3.1.2.2 转移接合子的稳定性
• 3.1.2.3 pJB5JI转移接合子共生效应的测定
• 3.1.2.4 Km抗性基因的扩增
• 3.1.2.5 小结和讨论
• 3.2 豌豆根瘤菌共生质粒与华癸中生根瘤菌7653R的相互作用
• 3.2.1 华癸中生根瘤菌7653R质粒的消除
• 3.2.1.1 7653R质粒稳定性的测定
• 3.2.1.2 7653R Tn5-mob-sacB转座突变株的获得与标记质粒的消除
• 3.2.1.3 7653R及其质粒消除的突变株的植物盆栽结瘤试验
• 3.2.1.4 小结和讨论
• 3.2.2 共生质粒pJB5JI向7653R和7653RD转移
• 3.2.2.1 转移接合子的鉴定
• 3.2.2.2 外源共生质粒pJB5JI在7653R和7653RD中的稳定性
• 3.2.2.3 转移接合子共生效应的测定
• 3.2.2.4 Kan抗性基因的扩增
• 3.2.2.5 小结和讨论
• 3.3 豌豆根瘤菌共生质粒和费氏中华根瘤菌的相互关系
• 3.3.1 HN01及其质粒缺失菌株的质粒检测及稳定性测定
• 3.3.2 共生质粒pJB5JI的转移和转移接合子的鉴定
• 3.3.3 转移接合子的稳定性
• 3.3.4 转移接合子共生效应的测定
• 3.3.4.1 转移接合子共生固氮能力的测定
• 3.3.4.2 转移接合子竞争结瘤能力的测定
• 3.3.5 转移接合子在共生条件下的稳定性
• 3.3.6 小结和讨论
• 3.4 豌豆根瘤菌遗传多样性的研究
• 3.4.1 豌豆根瘤菌16S rRNA基因PCR-RELP聚类分析
• 3.4.2 16S rRNA基因序列分析
• 3.4.3 16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP分析
• 3.4.4.RAPD聚类分析
• 3.4.5 小结和讨论
• 4 总结与展望
• 4.1 已取得的主要研究成果
• 4.2 进一步研究的设想
• 5 参考文献
• 致谢