论文摘要
抗菌肽是一种具有两亲活性阳离子短肽,在动物植物和人体内天然免疫中都发挥着重要作用。抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点。是极具潜力的新一代抗菌药物。由于抗菌肽天然产量低,从生物机体提取成本高、工序复杂,因此,利用基因工程技术生产具有高效抗菌活性抗菌肽,以降低抗菌肽生产成本有重要意义。本实验工作有下面几个方面：1.根据Genbank中的Dermadistinctin-L抗菌肽基因序列,按照大肠杆菌偏嗜密码子设计并人工合成含有互补区三个核苷酸片段,通过重叠区互补PCR法扩增得到完整的Dermadistinctin-L基因,在上下游引入中分别引入Sac I和HindⅢ限制性酶切位点,并在抗菌肽基因的两端引入肠激酶酶切位点。2.将获得的基因片段连接到pET32a（+）原核表达载体中,经过酶切测序鉴定,表明得到完全正确的重组质粒。将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,用IPTG诱导,初步确定Dermadistinctin-L蛋白可以正常表达且具有较高表达量。3.优化Dermadistinctin-L的表达条件,确定诱导条件为37℃,诱导5小时,0.1mM的工PTG浓度是最佳的表达条件。表达产物的分子量为24kDa,薄层蛋白扫描计算分析,显示表达蛋白量占总蛋白的30%,将大量诱导表达的Dermadistinctin-L融合蛋白经Ni亲和层析纯化得到纯化的Dermadistinctin-L蛋白纯度达到了80%以上。4.纯化的融合蛋白进行进行肠激酶酶切,对切割后的样品进行初步活性鉴定,确定了抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性。
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