草莓镶脉病毒中国分离物全基因组结构特征及其ORF VI基因功能鉴定

论文摘要

本研究测定了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）中国分离物的全基因组序列，并依据SVBV美国分离物序列中各ORF的特征，确定了SVBV中国分离物编码的6个ORF在其基因组中的准确位置。进一步根据SVBV中国分离物全序列克隆了6个ORF的完整序列，为后续SVBV功能基因研究提供了必需的序列资源。本研究还将SVBV中国分离物中的致病因子ORF VI转入拟南芥，观察ORF VI对拟南芥症状表型的影响。1. SVBV中国分离物全基因组序列的测定及其序列分析用CTAB法从已感染SVBV中国分离物的草莓叶片中提取总DNA，根据SVBV美国分离物已知序列，设计特异性引物分段扩增了SVBV中国分离物全基因组各部分片段，克隆并测序，序列拼接获得SVBV中国分离物全长基因组，基因组长7838bp。将其与花椰菜花叶病毒属其他成员以及SVBV美国分离物进行序列比对，结果发现，SVBV中国分离物与SVBV美国分离物相似性最高，达86.14%。再根据SVBV美国分离物各ORF特征，进一步确定了SVBV中国分离物6个ORF在其基因组中的准确位置，将其与花椰菜花叶病毒属其他成员对应的各个ORF进行序列比对，并构建了各ORF的系统关系树。2. SVBV中国分离物各个ORF的克隆根据拼接的SVBV中国分离物全基因组序列，在其编码的各个ORF上下游设计特异性引物，分别扩增SVBV中国分离物各ORF的完整片段，克隆并测序，和拼接的SVBV中国分离物基因组序列比较并校对，保存测序正确的各ORF克隆。3. ORF VI植物表达载体的构建及以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥将SVBV中国分离物ORF VI插入植物表达载体pCAM2300，构建重组植物表达载体pCAM P6。pCAM P6以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥，经抗性筛选，获得T0代转基因拟南芥植株。症状观察发现ORF IV转基因拟南芥症状表型与非转基因拟南芥植株无明显差异。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 植物病毒基因组概述
• 1.1 单链DNA病毒基因组
• 1.1.1 双生病毒科
• 1.1.2 矮缩病毒科
• 1.2 双链DNA病毒基因组
• 1.2.1 花椰菜花叶病毒属
• 1.2.2 杆状DNA病毒属
• 1.2.3 东格鲁病毒属
• 1.3 正义单链RNA病毒基因组
• 1.3.1 雀麦花叶病毒属
• 1.3.2 马铃薯Y病毒科
• 1.3.3 烟草脆裂病毒属
• 1.3.4 芜菁黄化花叶病毒属
• 1.3.5 马铃薯X病毒属
• 1.3.6 烟草花叶病毒属
• 1.4 负义单链RNA病毒基因组
• 1.4.1 弹状病毒科
• 1.4.2 尼布亚病毒科
• 1.4.3 纤细病毒属
• 1.5 双链RNA病毒基因组
• 1.5.1 呼肠病毒科
• 1.5.2 双分病毒科
• 2 花椰菜花叶病毒属基因组研究进展
• 2.1 花椰菜花叶病毒全基因组序列测序
• 2.2 花椰菜花叶病毒属病毒各ORF的研究
• 2.3 花椰菜花叶病毒基因组研究成果的应用概况
• 2.3.1 花椰菜花叶病毒属病毒的侵染性克隆
• 2.3.2 CAMV病毒载体
• 2.3.3 CAMV 35S启动子
• 引言
• 材料与方法
• 1 供试材料
• 1.1 病样来源
• 1.2 植物材料
• 1.3 菌种和载体
• 1.4 酶和化学试剂
• 1.5 常用缓冲溶液和培养基
• 1.6 抗生素
• 1.7 仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 叶片总DNA的提取
• 2.2 PCR技术
• 2.3 PCR产物的克隆
• 2.3.1 PCR产物回收和纯化
• 2.3.2 PCR产物的连接
• 2.3.3 感受态细胞的制备
• 2.3.4 连接产物的转化
• 2.3.5 阳性克隆的PCR鉴定
• 2.3.6 质粒提取
• 2.4 克隆基因的测序、分析和登录
• 2.5 克隆SVBV全基因组序列
• 2.5.1 SVBV全基因组序列克隆引物设计
• 2.5.2 PCR扩增SVBV全基因组序列
• 2.6 SVBV全基因组序列分析与克隆
• 2.6.1 确定各SVBV中国分离物各个ORF序列位置
• 2.6.2 SVBV中国分离物各个ORF序列相似性分析
• 2.6.3 SVBV中国分离物各个ORF序列克隆引物的设计
• 2.6.4 SVBV中国分离物各个ORF序列的PCR扩增
• 2.7 植物表达载体的构建
• 2.7.1 植物表达载体的构建策略
• 2.7.2 植物表达载体的构建方法
• 2.8 液氮冻融法转化根癌土壤杆菌
• 2.9 花苞浸泡法转化拟南芥
• 2.12 转基因拟南芥的PCR鉴定
• 结果与分析
• 1 SVBV全基因组序列的测定
• 2 SVBV全基因组序列的序列分析与克隆
• 2.1 SVBV中国分离物全基因组序列与同属病毒全基因组序列相似性分析
• 2.2 SVBV中国分离物各ORF位置的确定
• 2.3 SVBV中国分离物各ORF序列与同属其他病毒对应ORF序列相似性分析
• 2.4 SVBV各ORF序列的PCR扩增与克隆
• 3 SVBV中国分离物 ORF VI 植物表达载体的构建
• 4 拟南芥的转化和卡那抗性植株的获得
• 讨论
• 1 SVBV全基因组序列的测定与分析
• 2 SVBV中国分离物各ORF的克隆
• 3 SVBV中国分离物ORF VI植物表达载体的构建与拟南芥转化
• 结论
• 参考文献
• 附录A：常用缓冲液及培养基配方法
• 附录B：常用的抗生素和激素及使用浓度
• 附录C：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录D：本文所用的重要缩写词及中文对照
• 附录E：草莓镶脉病毒中国分离物全基因组序列
• 致谢
• 作者简介