应用单抗夹心ELISA检测伪狂犬病毒和胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA在巴斯德毕赤酵母中的表达及检测方法研究

论文摘要

本论文包含2个部分。 1.检测猪伪狂犬病毒单抗夹心ELISA方法的建立和应用 伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus, PrV）引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失,猪是本病毒的天然宿主和贮存者。准确、及时地检测出病原是防止疾病扩散的重要措施之一。单克隆抗体的各种诊断方法在其它疾病的检测中得到广泛的应用,显示出灵敏性高、特异性强等优点。应用单克隆抗体来检测PrV在我国报道较少,为了能从感染PrV的动物体内和肉食品中检测出病原,本课题开展了以下研究。 1.1 将猪伪狂犬病毒Ea株在IBRS-2细胞上增殖培养后,纯化后免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合。经ELISA筛选,获得两株分泌抗PrV单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞,分别命名为4A6F5和3G7E3。免疫荧光试验和交叉试验证明两种单抗能特异性地与PrV反应,小鼠腹水中MAb的ELISA效价均为1:100×212。这两株单克隆抗体为病毒抗原的诊断研究提供良好的材料。 1.2 用纯化的病毒免疫健康猪,制备了抗PrV血清,提纯了IgG;将效价较高的一株单克隆抗体和抗血清IgG分别作为捕获抗体和检测抗体,用于建立检测PrV的双抗体夹心间接ELISA方法,并优化了反应条件,检测结果显示,该方法对PrV的检测灵敏度达31.2ng（0.312μg/ml）,与乙型脑炎病毒（JEV）、猪繁殖与呼吸障碍综合症（PRRSV）、细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等病毒无交叉反应。批间和批内变异系数较小,介于为4.87%和1.07%之间。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PCR对159份临床病料进行平行检测,二者的符合率可达到77.4%。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可应用于发病动物组织中PrV检测。 1.3 从武汉市及其周边地区市场收集97头份猪肉样本、57头份羊肉样本、50头份牛肉样本,应用双抗体夹心ELISA和聚合酶链式反应（PCR）方法平行检测样本中的伪狂犬病毒。检测结果显示:97头份猪肉样中,双抗体夹心ELISA方法PrV检出19份（19.6%）,gD-PCR检出25份（25.6%）;牛样本中ELISA阳性数为0,PCR阳性2份（4%）;羊样本中两种方法均为阴性。这2种方法均为阳性和阴性的总份数为12和170份,总符合率达到了89.2%,对部分ELISA阳性的样本,病毒分离也为阳性。 2 猪传染性胸膜肺炎毒素Ⅲ在巴斯德毕赤酵母中的表达和应用 胸膜肺炎放线

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备以及单抗ELISA检测方法的建立和应用
• 1 文献综述
• 1.1 伪狂犬病病原
• 1.1.1 病原特征
• 1.1.2 基因组结构
• 1.1.3 伪狂犬病毒的糖蛋白
• 1.2 血清学诊断检测
• 1.2.1 微量血清中和试验（MSN）
• 1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.3 乳胶凝集试验（LAT）
• 1.2.4 间接血凝试验（IHA）
• 1.2.5 对流免疫电泳（CIE）
• 1.2.6 鉴别诊断ELISA
• 1.3 病原学诊断检测
• 1.3.1 病毒分离
• 1.3.2 兔体接种试验
• 1.3.3 反向间接血凝试验（RPHA）
• 1.3.4 免疫荧光试验（IFA）
• 1.3.5 双抗体夹心ELISA
• 1.3.6 聚合酶链式反应（PCR）技术
• 1.3.7 核酸探针技术
• 1.4 预防和控制
• 2 研究目的和意义
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒株与细胞系
• 3.1.2 培养基及主要试剂
• 3.1.3 ELISA相关溶液
• 3.1.4 酶、抗血清及引物
• 3.1.5 实验动物和肉样样本
• 3.2 方法
• 3.2.1 抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备
• 3.2.1.1 抗原的制备
• 3.2.1.2 动物免疫
• 3.2.1.3 SP2/0骨髓瘤细胞的活化
• 3.2.1.4 SP2/0瘤细胞的制备
• 3.2.1.5 免疫脾细胞的制备
• 3.2.1.6 饲养细胞的制备
• 3.2.1.7 细胞融合
• 3.2.1.8 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清
• 3.2.1.9 杂交瘤细胞的克隆化
• 3.2.1.10 单克隆抗体的生产和效价测定
• 3.2.1.11 单克隆抗体的结合活性测定
• 3.2.1.12 交叉试验
• 3.2.2 双抗体夹心ELISA诊断方法的建立
• 3.2.2.1 抗伪狂犬病毒阳性血清制备与IgG提纯
• 3.2.2.2 双抗体夹心ELISA方法的建立
• 3.2.2.3 检测方法的条件优化
• 3.2.2.4 灵敏度测定
• 3.2.2.5 特异性试验
• 3.2.2.6 阻断试验
• 3.2.2.7 重复性和稳定性实验
• 3.2.2.8 病料和肉样的收集及检测
• 4 结果和分析
• 4.1 免疫小鼠后血清抗体效价
• 4.2 杂交瘤细胞的筛选
• 4.3 单克隆抗体的效价
• 4.4 单克隆抗体间接免疫荧光
• 4.5 双抗体夹心ELISA最佳反应条件的确定
• 4.6 双抗体夹心ELISA敏感性检测
• 4.7 双抗体夹心ELISA特异性试验
• 4.8 双抗体夹心ELISA阻断试验结果
• 4.9 双抗体夹心ELISA稳定性检测
• 4.10 人工感染仔猪病料检测
• 4.11 临床病料检测及与PCR的比较
• 4.12 市场收集肉样检测结果
• 5 讨论
• 5.1 小鼠抗原的纯度
• 5.2 小鼠免疫方法
• 5.3 瘤细胞SP2/0的使用方法
• 5.4 关于3G7E3和4A6F5杂交瘤细胞
• 5.5 抗体纯化
• 5.6 双抗体夹心ELISA检测PrV的可行性
• 5.7 肉食品市场肉样检侧结果分析
• 6 结论
• 第二章 胸膜肺炎放线杆菌毒素IIIA（ApxIIIA）基因在巴斯德毕赤酵母中的表达APxIIIA-ELISA方法的建立
• 1 胸膜肺炎放线杆菌文献综述
• 1.1 胸膜肺炎放线杆菌起源、传播特点和危害
• 1.2 胸膜肺炎放线杆菌及其流行病学
• 1.3 毒力相关因子
• 1.4 胸膜肺炎实验室诊断方法
• 1.5 预防和控制
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 酶及主要试剂
• 3.1.3 血清
• 3.1.4 细菌培养基
• 3.1.5 质粒抽提
• 3.1.6 E.coli感受态制备
• 3.1.7 酵母培养基
• 3.1.8 酵母转化用试剂
• 3.1.9 SDS-PAGE相关溶液
• 3.1.10 引物及其他
• 3.2 方法
• 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.2 PCR扩增ApxIIIA基因
• 3.2.3 DNA的回收
• 3.2.4 连接产物的转化
• 3.2.5 质粒的少量制备
• 3.2.6 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.7 DNA重组技术（DNA酶切、连接）
• 3.2.8 酵母菌的转化（LiCl法）
• 3.2.9 重组酵母的表达
• 3.2.10 SDS-PAGE检测及Dot-blotting鉴定
• 3.2.11 APxIIIA-ELISA试验条件的确定
• 3.2.12 酶标板保存期的测定
• 3.2.13 ApxIIIA-ELISA与IHA比较
• 4 结果与分析
• 4.1 PCR扩增结果的鉴定
• 4.2 转移载体和表达载体的构建
• 4.3 重组表达蛋白SDS—PAGE检测及Dot-blotting分析
• 4.4 ELISA结果判定标准的确定
• 4.5 交叉反应
• 4.7 重复性实验
• 4.8 APxIIIA-ELISA与IHA之间的比较
• 5 讨论
• 5.1 毒素及其表达系统的选择
• 5.2 关于表达蛋白的检测
• 5.3 关于ApxIIIA-ELISA方法
• 5.4 ApxIIIA-ELISA和IHA检测结果分析
• 6 结论
• 参考文献
• 缩略表
• 致谢