论文摘要
应激相关激素去甲肾上腺素（NE）对机体免疫功能的影响已受到学者们的广泛关注。以往研究结果提示，NE能促进或加剧内毒素休克、过敏性疾病、慢性炎症性疾病以及肿瘤等，但对其作用机制尚不很清楚。长期反复应激导致NE释放从而致使机体炎症和免疫功能发生改变，甚而影响到个体健康状态的研究，对其进行研究具有重要的理论和实践意义。众所周知，巨噬细胞广泛分布于机体全身，被刺激后能释放种类繁杂的细胞因子等物质，参与调节免疫系统功能。除分泌炎症因子等之外，巨噬细胞在某些刺激物如LPS等作用下会合成分泌相当数量的神经肽类物质以及NE等。与此同时，交感神经末梢细密的分布在全身各个脏器，而且在那些存在相当数量巨噬细胞的免疫器官中，也广泛分布有交感神经末梢。如淋巴结、脾脏和胸腺等免疫器官，交感神经末梢极其丰富，甚至存在着类似于“突触”样的结构基础，而且在免疫系统，巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等都有NE受体表达，这些结构可能为其在局部发挥作用提供结构基础，也提示交感神经系统与免疫系统间相互作用的紧密性和直接性。除下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴外，交感神经系统是另一个重要的应激反应系统。在应激时交感神经末梢兴奋，其释放的NE是血液中NE的主要来源。无论是交感神经释放NE，还是自身受到LPS刺激后分泌NE，巨噬细胞很容易处身于一个富于NE的微环境。近年来，模式识别受体TLR受到免疫学家的高度重视，被认为是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。有文献报道，NE能够调节心血管细胞的氧化应激，而活性氧（ROS）参与调节toll样受体4（TLR4）表达。那么，NE能否调节TLR4呢?NE是否可能通过调节巨噬细胞氧化应激进而调节TLR4?为此，我们设计并进行了以下实验：（1）从整体水平，检验NE是否能够调节模式识别受体TLR4的表达。应用束缚应激模型，通过免疫组化观察模型小鼠脾脏TLR4表达变化，并观察束缚应激小鼠LPS所致休克后72 h存活率。（2）Western blot及Quantitative real time PCR技术检测NE对体外巨噬细胞TLR4表达的影响。（3）Western blot检验ROS是否能够调节TLR4表达。观察不同剂量的活性氧对TLR4表达的调节作用，应用细胞色素C还原法及活性氧荧光探针法检测NE是否能够影响巨噬细胞氧化应激状态。（4）NE或ROS处理过的巨噬细胞，ELISA检测在LPS刺激下TNFα变化，化学发光法检测NO生成变化。（5）探讨NE调节巨噬细胞氧化应激状态的具体机制，Western blot检测NE可能是通过影响PKC进而影响NADPH氧化酶等。主要结果如下：（1）免疫组化结果发现慢性束缚应激后的模型小鼠脾脏组织TLR4表达增高，与注射6-OHDA后束缚应激小鼠相比，TLR4表达量也显著增加。（2）NE能够促进体外巨噬细胞TLR4表达。不同剂量的NE处理巨噬细胞12 h和24 h后，小鼠巨噬细胞TLR4蛋白表达量及mRNA转录显著增加，β受体阻断剂Propranolol及α受体阻断剂Phtentolamine都能部分阻断其上述作用，还原剂N乙酰半胱氨酸能部分阻断NE对TLR4表达的促进作用。（3）NE能够促进巨噬细胞产生ROS，后者能够调节TLR4。不同剂量的NE能够促进巨噬细胞产生ROS，而且具有剂量依赖性。ROS调节TLR4表达具有双向性。高剂量（>100μM）的H2O2抑制TLR4表达，而较低剂量（10μM）则促进TLR4表达。（4）NE或者H2O2处理巨噬细胞24 h后，再用LPS刺激巨噬细胞后产生的TNFα和NO比LPS单纯刺激组显著增加。（5）NE能够促进PKC磷酸化，β受体阻断剂Propranolol及α受体阻断剂Phentolamine都能部分阻断其作用。