论文摘要
尽管近年来天然免疫研究进展十分迅速,但是天然免疫的本质亟待揭示和阐明。随着Janeway CA Jr等提出天然免疫通过模式识别作用启动获得性免疫应答并左右其应答类型的假说,模式识别分子成为了免疫学的研究热点之一。模式识别分子是天然免疫的重要分子,根据其存在的形式,可分为可溶性和细胞膜表面两大类。已经发现,膜相模式识别受体中Toll样受体家族（Toll-likereceptors,TLR）、巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose recetor,MR）和可溶性模式识别分子中的胶凝素（collectins）家族成员肺表面活性物质脱辅基蛋白A和D（surfactant protein A、surfactant protein D,SP-A、SP-D）等是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。天然免疫模式识别作用正直逼免疫应答的核心问题——应答的启动及其调控。甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）与SP-A、SP-D同属于胶凝素家族,主要由肝细胞分泌,作为糖蛋白存在于血浆中。MBL的一级结构至高级结构均与补体分子C1q高度同源。MBL的主要功能区有二,即糖识别域（carbohydrate-recognition domain,CRD）和胶原样区（collagen-like region,CLR）。前者是识别功能区,能以Ca2+依赖方式识别多种病原体表面的糖结构。后者为效应功能区,与2个MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL associated serineprotease,MASP-1,MASP-2）结合而激活补体凝集素途径,在天然免疫中发挥防御作用,这是MBL作为补体成分的作用。近年来,对MBL的免疫调节作用亦有一些报道。国外相关研究表明,MBL可抑制DC-SIGN介导的T细胞应答,调节外周血单个核细胞（peripheral blood monoeuclear cell,PBMC）分泌细胞因子。本课题组以前的工作也发现MBL具有免疫调节作用:能抑制LPS刺激DC功能的成熟,抑制LPS刺激不同分化和活化状态的人单核细胞系THP1/CD14细胞产生TNF-α和IL-12。然而,有关MBL免疫调节作用的机制,目前国内外尚未见相关报道。本研究中,我们以人单核细胞系THP1/CD14为细胞模型,初步研究了MBL与THP1/CD14细胞的结合、结合的特性和MBL与TLR的相互作用。一、MBL与人单核细胞系THP1/CD14细胞结合采用Cell-ELISA和流式细胞术,对MBL是否与THP1/CD14细胞结合进行了研究。Cell-ELISA结果显示,MBL能以浓度依赖方式与THP1/CD14细胞结合。以流式细胞术分析发现,在无Ca2+存在的或以EDTA取代CaCl2的结合缓冲液中,MBL与THP1/CD14细胞几乎不结合;而在含5 mmol/L或10 mmol/LCaCl2的结合缓冲液中,MBL与THP1/CD14细胞可以结合,且在含10 mmol/LCaCl2的结合缓冲液中结合能力比较强,提示二者的结合呈Ca2+浓度依赖关系。结果表明,从血浆天然MBL在生理条件下确实可以结合THP1/CD14细胞,且这种结合具有Ca2+浓度依赖性,提示THP1/CD14细胞上可能存在MBL的受体或结合蛋白,且二者结合需要Ca2+参与。二、MBL与THP1/CD14细胞结合特性的研究一般认为,MBL可结合单核巨噬细胞表面的胶凝素受体即C1q受体（C1qreceptor,C1qR）。然而,根据上述结果,我们推测MBL可能通过其CRD与细胞表面某些糖蛋白或其他糖结构结合。本课题组已分段表达了重组人MBL的CLR（rhMBL-CLR）和CRD（rhMBL-CRD）蛋白,建立了分泌抗人C1qR单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）的杂交瘤E8,为本部分的实验提供了基础。在本实验中,我们首先制备了抗人C1qR mAb E8、rhMBL-CLR和rhMBL-CRD蛋白,然后采用流式细胞术对MBL结合THP1/CD14细胞的功能区进行了研究,检测了多种糖、rhMBL-CRD、rhMBL-CLR、C1q和E8对THP1/CD14细胞与MBL结合的抑制作用。结果显示,THP1/CD14细胞与MBL的结合能被某些糖抑制;rhMBL-CRD、rhMBL-CLR蛋白单独能部分抑制其结合,两者联合则可达完全抑制效果;但C1q和E8无抑制作用。资料表明,THP1/CD14细胞表达糖敏感的MBL受体或结合蛋白,包括对CLR和CRD特异的两种受体,均与C1qR无关;MBL可能以一种以上的方式结合THP1/CD14细胞。三、MBL与TLR关系的初步研究TLR-2是人类TLR家族成员中表达范围最广泛,识别病原微生物及其产物种类最多的分子,也是单核巨噬细胞主要表达的TLR之一。本部分研究中,我们首先采用ELISA、Western blot对TLR-2能否直接与MBL结合进行了分析,结果表明MBL能直接结合真核表达的重组TLR-2胞外段蛋白。对LPS刺激THP1/CD14细胞结合MBL的情况进行研究,ELISA结果显示,MBL与100 ng/LLPS刺激的THP1/CD14细胞结合能力比无LPS刺激者强,且sTLR-2蛋白可部分抑制这种结合;流式细胞术结果同样表明,LPS刺激的THP1/CD14细胞的MBL结合能力增强,且具有LPS浓度依赖性,随着LPS浓度增高,结合逐渐加强。然后,我们采用RT-PCR分析了LPS刺激对细胞TLR-2、TLR-4 mRNA表达的影响,发现LPS刺激2 h后THP1/CD14细胞TLR-2、TLR-4 mRNA表达水平增高;24 h后有所下降,接近与未刺激时水平。最后,提取未刺激的、LPS刺激的和MBL加LPS共同刺激的THP1/CD14细胞的核蛋白,采用Western bolt方法分析和转录因子NF-κB的转位,发现MBL可抑制LPS诱导NF-κB转位,表明MBL调节细胞因子分泌的机制可能与抑制NF-κB转位有关。上述研究结果表明,THP1/CD14细胞表达Ca2+依赖性、糖敏感的MBL受体或结合蛋白,包括对CLR和CRD特异的两种受体,均与C1qR无关。MBL可与TLR-2胞外段结合;LPS刺激后的THP1/CD14细胞结合MBL能力增强,这与LPS刺激THP1/CD14细胞TLR-2和TLR-4的mRNA表达增高是一致的;MBL与THP1/CD14细胞的结合能被sTLR-2蛋白部分抑制;MBL可抑制LPS诱导THP1/CD14细胞核转录因子NF-κB的转位。因此提出,MBL抑制LPS刺激THP1/CD14细胞产生促炎细胞因子可能与两方面的机制有关:①THP1/CD14细胞在LPS刺激下TLR2和TLR4表达量增加,导致其与MBL的结合力增强、结合量增多;②MBL抑制LPS诱导的核转录因子NF-κB的转位。
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标签：甘露聚糖结合凝集素论文; 受体论文; 结合蛋白论文; 细胞论文; 样受体论文;