论文摘要
本研究根据GenBank上公布的欧洲兔白介素6全基因序列，用Primer 5.0软件设计一对引物，用RT-PCR方法从ConA刺激诱导的中国白兔外周淋巴细胞的总RNA中扩增出中国白兔白细胞介素（IL-6）基因cDNA，并对其进行克隆测序与分析。结果表明：成功地克隆出了中国白兔白IL-6基因，其开放阅读框为726bp，包含241个氨基酸残基；与欧洲兔IL-6基因（AF169176）同源性为100％，与GenBank上公布的其他的几种兔的IL-6基因不完全序列的同源性从84.9-91.1％不等。将所获得的中国白兔IL-6基因序列登录到GenBank上，登录号为：EF126499。目前很少有关兔白细胞介素的报道，兔IL-6的克隆在国内未见报道。将中国白兔IL-6基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）上，构建真核表达质粒pcDNA-IL-6。对其进行菌落PCR、双酶切和测序鉴定重组子。实验结果表明：成功地构建了中国白兔IL-6的真核表达质粒。本研究构建的pcDNA-IL-6真核表达质粒在国内外尚属首次，为进一步研究中国白兔IL-6的分子佐剂效应提供了基础材料。将构建的真核表达质粒pcDNA-IL-6用脂质体包裹，制备成分子佐剂。进一步研究中国白兔IL-6对疫苗的免疫佐剂效应。本研究将实验室已构建的兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因真核表达质粒pcDNA-VP60通过脂质体转染法转染真核传代细胞Vero细胞，培养48h后，用免疫荧光试验观察真核表达质粒pcDNA-VP60在Vero细胞中的表达情况。结果表明：真核重组质粒在Vero细胞中成功地表达具有免疫原性的VP60蛋白，为进一步研究兔出血症病毒VP60 DNA疫苗提供了科学依据。本研究采用大提质粒的方法抽提并纯化质粒pcDNA-VP60，用脂质体包裹后制成pcDNA-VP60 DNA疫苗／脂质体复合物，为免疫实验提供材料。免疫实验将25只20日龄，600g-700g的断奶非免疫健康中国白兔，随机分成5组，1组pcDNA3.1空载体，2组RHD组织灭活苗，3组RHD组织灭活苗+pcDNA-IL6-脂质体复合物，4组pcDNA-VP60-脂质体复合物，5组pcDNA-VP60+pcDNA-IL-6-脂质体复合物，经后腿部内侧肌肉多点注射，免疫两次，两次免疫间隔时间为20天。免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、70d采集血，收集血清，56℃30min灭能后，用血凝抑制试验检测血清中特异性抗体的效价，用SPSS软件对实验数据进行统计分析。免疫试验结果表明：RHD pcDNA-VP60／脂质体复合物与pcDNA-VP60+pcDNA-IL-6-脂质体复合物免疫中，均能诱导机体产生特异性抗体，各实验组与空载体对照组相比，差异都极显著p＜0.01；但是与组织灭活苗相比差异不显著p＞0.05。核酸疫苗免疫后35天抗体达到峰值。分子佐剂pcDNA-IL6对RHD核酸疫苗pcDNA-VP60和组织灭活苗的体液免疫均具有免疫增强作用，在免疫后的7d到70d，无论是RHD核酸疫苗pcDNA-VP60或是组织灭活苗，与分子佐剂pcDNA-IL6共注射免疫组抗体都高于未加分子佐剂免疫组，差异均显著p＜0.05或极显著p＜0.01。第3组和第5组免疫后产生的特异性抗体滴度明显高于对照组，第2组和第3组，差异均显著p＜0.05或极显著p＜0.01。攻毒实验，对照组和第4组保护率很低，在RHDV强毒的攻击时得不到很好的保护，而在添加有分子佐剂的第5组和第3组，却得到了很好的保护。说明分子佐剂pcDNA-IL6有促进机体抵抗强毒的攻击的趋势。本研究为RHD DNA疫苗的研究和应用提供了科学依据。