脂环酸芽孢杆菌A.contaminans α-葡萄糖苷酶纯化与固定化研究

论文摘要

本论文从源于陕西果园的脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus contaminans简称A.contaminans）中分离、纯化出α-葡萄糖苷酶,系统研究了α-葡萄糖苷酶的酶学性质和生化性质,研究获得了固定化α-葡萄糖苷酶最优条件,其主要研究结果如下:1.A. contaminansα-葡萄糖苷酶的纯化方法为:粗酶液制备经硫酸铵盐析沉淀、阴离子交换层析Q-Sepharose Fast Flow、凝胶过滤层析Sephacryl S-200 High Resolution、吸附层析羟基磷灰石CHT Ceram Hydroxyapatite。获得的α-葡萄糖苷酶的比活力比初始发酵液酶活提高了23倍。2.A. contaminansα-葡萄糖苷酶最适反应pH为5.4,最适温度为52℃,在52℃以下、pH值为5.2-7.5时酶的稳定性较高;Ba2+、Al3+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+和EDTA对α-葡萄糖苷酶活力的影响不明显,Cu2+、Ni2+、Fe3+、β-巯基乙醇对酶活力有强烈的抑制作用,Fe2+、Li+对酶活具有一定的促进作用;以pNPG为底物的Km值为0.019mg/ml,Vmax为3.02 mmol/ml·min;分离获得的α-葡萄糖苷酶可以有效水解含α-（1→4）,α-（1→3）,α-（1→1）,α-（1→6）糖苷键的麦芽糖、黑曲霉糖、海藻糖和异麦芽糖,但不能降解含有α-（1→2）的曲二糖;A. contaminansα-葡萄糖苷酶不具有转糖基作用。3.通过SDS-PAGE测定该酶蛋白的分子量约为70kDa;圆二色谱测定得知此α-葡萄糖苷酶含有36.4%的α-螺旋、3.0%的β-折叠、22.4%β-转角和38.2%的无规则卷曲;利用MALDI-TOF-MS技术对纯化的α-葡萄糖苷酶肽指纹图谱进行鉴定证明从A. contaminans中分离得到的α-葡萄糖苷酶为一种新的α-葡萄糖苷酶。4.在α-葡萄糖苷酶的固定化中,使用载体Ⅰ壳聚糖-戊二醛的制备方法可以得到固定化效果最好的固定化酶;当戊二醛浓度为0.2mol/L、戊二醛交联时间为12h、交联pH值为7.5和交联温度为15℃固定化效果最好;固定化酶的最适pH值为4.5,最适反应温度为55℃,其可以在4.5-8.0的pH值范围间保持酶的活性不受损失,当温度为65℃时,固定化酶可以保持将近100%酶活力,将酶储存三周可以保持80%以上酶活,当重复使用6次后,酶剩余活力保持在80%左右。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 α-葡萄糖苷酶介绍
• 1.1.1 α-葡萄糖苷酶理化性质
• 1.1.2 α-葡萄糖苷酶活性测定方法
• 1.1.3 α-葡萄糖苷酶生物学功能
• 1.1.4 α-葡萄糖苷酶应用
• 1.2 耐热性α-葡萄糖苷酶
• 1.2.1 耐热性α-葡萄糖苷酶的来源
• 1.2.2 耐热性α-葡萄糖苷酶的热稳定性
• 1.3 酶的分离纯化方法
• 1.3.1 酶的粗分离纯化方法
• 1.3.2 酶的精分离纯化方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 本论文的研究内容
• 第三章 A. contaminans α-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料、试剂、仪器
• 3.1.2 粗酶制备及纯化
• 3.1.3 最适 pH 值及 pH 耐受性测定
• 3.1.4 最适温度及温度耐受性测定
• 3.1.5 金属离子及螯合物对酶活影响
• 3.1.6 底物特异性
• 3.1.7 酶促反应动力学
• 3.1.8 转糖基作用测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 最适反应 pH 及耐受性测定
• 3.2.2 最适反应温度及温度耐受性测定
• 3.2.3 金属离子及螯合剂对酶催化反应的影响
• 3.2.4 α-葡萄糖苷酶底物特异性
• 3.2.5 α-葡萄糖苷酶的反应动力学
• 3.2.6 A. contaminans α-葡萄糖苷酶的转糖基作用
• 3.3 小结与讨论
• 3.3.1 小结
• 3.3.2 讨论
• 第四章 A. contaminans α-葡萄糖苷酶生化性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 分子量测定
• 4.1.3 圆二色光谱测定
• 4.1.4 肽指纹图谱测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 相对分子质量测定
• 4.2.2 圆二色光谱分析
• 4.2.3 MALDI-TOF-MS 质谱仪测定肽指纹图谱
• 4.3 小结与讨论
• 4.3.1 小结
• 4.3.2 讨论
• 第五章 A. contaminans α-葡萄糖苷酶固定化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料、试剂与仪器
• 5.1.2 游离酶的制备
• 5.1.3 固定化酶的制备
• 5.1.4 酶活力的测定
• 5.1.5 壳聚糖固定化 α-葡萄糖苷酶处理条件的确定
• 5.1.6 固定化酶的性质
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不同载体的固定化效果比较
• 5.2.2 载体Ⅰ固定化 α-葡萄糖苷酶处理条件的确定
• 5.2.3 A. contaminans α-葡萄糖苷酶固定化酶的性质
• 5.3 小结与讨论
• 5.3.1 小结
• 5.3.2 讨论
• 第六章 讨论与结论
• 6.1 讨论
• 6.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介