论文摘要
目的:纳米颗粒因为其极小尺寸、极大的表面积而具有特殊的生物与化学活性,人类环境中大量地使用纳米材料,除研究其广泛的应用价值,还迫切需要研究它是否具有可能的内在的细胞毒性,特别是对女性生殖内分泌系统潜在的可能影响。本文研究二氧化钛（TiO2）纳米对雌性小鼠的在体作用,着重观察其对雌性小鼠生殖系统的影响;进而研究磷酸钙纳米和TiO2纳米对人黄素化颗粒细胞的作用,包括对细胞周期、细胞凋亡、雌、孕激素生成及相关甾体生成酶的影响。方法: （1）5周龄的雌性小鼠隔日腹腔注射TiO2纳米（200、500 mg/kg）,对照组注射等体积生理盐水,共给药5次。停药1周后,测量各重要脏器的脏器质量系数、测定血清生化指标、雌二醇和孕激素水平,主要脏器作病理切片和HE染色。（2）原代培养人黄素化颗粒细胞,培养72小时后以0、10μΜ、100μΜ三个不同浓度的磷酸钙纳米和0、10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml浓度的TiO2纳米处理细胞,继续培养72小时,用电镜观察磷酸钙纳米进入颗粒细胞的情况,用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化,用超敏感的固相放射免疫方法测定培养液中孕酮和雌二醇水平的变化,用反转录——半定量PCR法测定颗粒细胞内雌、孕激素合成与转化相关的酶:芳香化酶（P450arom）、胆固醇侧链裂解梅（P450Scc）和类固醇合成急性调节蛋白（StAR）的mRNA表达水平。结果:（1）与对照组相比,给药TiO2纳米200 mg/kg（低剂量组）和500 mg/kg（高剂量组）组小鼠主要脏器的质量系数变化未见统计学意义（P均>0.05）;低剂量组和高剂量组小鼠的血生化指标中,ALT/AST比值均有降低,（P均<0.05）,这两项指标提示肝功能有轻度损伤;高剂量组小鼠UA轻度升高,有统计学意义（P<0.05）,提示高剂量TiO2纳米作用下肾功能亦有轻度损伤;此外,高剂量组小鼠α-羥丁胺酸（α-HBDH）增高明显,提示较大剂量TiO2纳米作用下心肌也有轻度的损伤。与对照组比,低剂量组和高剂量组小鼠血雌二醇、孕酮水平均没有显著变化（P>0.05）,组织病理也未发现明显异常。（2）磷酸钙纳米处理培养的人黄素化颗粒细胞72小时后,电镜下观察到纳米颗粒聚集分布在颗粒细胞的囊性细胞器,如溶酶体、线粒体等中聚集,或被细胞膜包裹成吞饮小泡存在于细胞浆中。处理4和24小时,细胞浆内仅有极少纳米颗粒分布。（3）用100uM浓度的磷酸钙纳米作用于颗粒细胞48小时后,发现S期细胞增加（从6.28±1.55%增加到11.18±1.73%）（P<0.05）。S期/（G2/M2）期的细胞比率也明显增加（从0.89±0.11%增加到1.38±0.32%）（P<0.05）。细胞凋亡率检测结果显示,对照组颗粒细胞的凋亡率是11.18±1.73%,磷酸钙纳米作用48h后凋亡率增加至16.53±5.56%（P<0.05）。磷酸钙纳米处理72h后,颗粒细胞的凋亡率从5.69±3.64%增加至15.76±7.02%（P<0.05）。在磷酸钙纳米处理颗粒细胞后,颗粒细胞DNA断裂增加,S期细胞增加,S期转化为G2/M期停滞,S期/（G2/M）期的细胞比率也明显升高（P均<0.05）,提示DNA合成的抑制。（4）用TiO2纳米处理培养的人黄素化颗粒细胞,细胞周期也发生变化,用200μg/mlTiO2纳米作用48小时,S期的细胞增加（从11.18±7.04%增加到20.12±10.94%, P>0.05）。S期/（G2/M2）期的细胞比率也明显增加（从2.13±2.54%增加至6.81±8.90%,P<0.05）。细胞凋亡检测显示,对照组的细胞凋亡率是14.51±7.10%,TiO2纳米作用48h后的细胞凋亡率为27.78±15.48%（P<0.05）。同样,TiO2纳米作用72h后,细胞凋亡率从10.51±0 .66%增加至19.21±7.54%（P<0.05）。（5）磷酸钙纳米和TiO2纳米处理后,黄素化颗粒细胞分泌的雌、孕激素水平均无显著变化（P>0.05）,雌、孕激素相关生成酶的基因:P450arom mRNA P450Scc mRNA及调节因子StAR mRNA的表达水平无显著变化（P>0.05）。结论:（1）低剂量TiO2纳米对小鼠各系统器官的生化指标无显著影响;高剂量TiO2纳米对小鼠肝、肾和心功能则有轻度影响,但对小鼠雌、孕激素的分泌及卵巢组织病理无明显影响。因此, TiO2纳米在200500 mg/kg剂量的短期作用对雌性小鼠性腺的卵泡细胞和激素分泌没有产生明显的毒性作用。（2）磷酸钙纳米能直接进入卵巢颗粒细胞。（3）磷酸钙纳米和TiO2纳米均能影响颗粒细胞的细胞周期及诱导凋亡,但对颗粒细胞雌、孕激素的合成与分泌没有显著影响。
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