罗非鱼髓样分化因子（MyD88）的克隆与表达分析

论文摘要

髓样分化因子（myeloid differentiation factor88, MyD88）是IL-1R/TLR信号通路（TLR3除外）的关键接头蛋白,可激活核转录因子（nuclear factor-kappaB,NF-κB）的产生,在天然免疫中具有重要作用。罗非鱼作为重要的世界性养殖鱼类,有关MyD88及其介导的信号通路相关因子的研究尚未见报道。本文通过RACE-RCR技术克隆了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼MyD88基因,对其进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术检测两种罗非鱼MyD88在不同组织中的表达。序列分析表明奥利亚罗非鱼MyD88cDNA序列全长1611bp,5’UTR为155bp,3’UTR为589bp；尼罗罗非鱼MyD88基因全长为1572bp,5’UTR为118bp,3’UTR为587bp；开放阅读框长度均为867bp,共编码288个氨基酸。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼MyD88核苷酸序列相似性高达99%。利用在线软件SMART程序对推导的氨基酸序列分析其功能结构域,其结果表明,罗非鱼MyD88蛋白具有典型的MyD88结构,具有N端的死亡结构域,中间的连接结构域和c末端的TIR结构域；其中TIR结构域包含三个高度保守的区域：boxl（FDAFICYCQ）, box2（LCVFDRDVLPGSC）,和box3（FWTRL）。同源性分析表明,罗非鱼MyD88与其他物种MyD88之间有较高的氨基酸和编码区序列相似性,与鳜鱼氨基酸相似性高达85.8%,核苷酸相似性为84.7%,与其他鱼类核苷酸相似性为69%-82%,与哺乳动物核苷酸相似性为63%-64%；与无脊椎动物扇贝（核苷酸相似性31.8%,氨基酸相似性9.2%）、果蝇（核苷酸相似性21.9%,氨基酸相似性3.3%）的序列相似性最低。系统进化树分析表明,鱼类MyD88聚为一支,与无脊椎动物距离较远；罗非鱼MyD88与同属鲈形目的鳜鱼、大黄鱼聚在一起,具有很近的亲缘关系。为对罗非鱼MyD88进行组织定量检测,根据所测罗非鱼MyD88基因序列设计并合成特异性引物,以β-actin为内参基因,建立了以SYBR Green染料为荧光指示剂的MyD88实时定量PCR方法。实验以尼罗罗非鱼肝脏组织cDNA为标准样品,进行5倍梯度稀释,分别以3次平行重复和5个连续梯度稀释样品进行扩增,根据所得到的标准曲线对两基因PCR扩增效率进行判定。结果表明,MyD88和β-actin基因的扩增效率分别为100%和96.7%,相关系数分别为0.998和0.995；扩增产物均形成单一的特异性熔解峰；而且MyD88和β-actin基因标准曲线斜率差小于0.1,可认为其扩增效率基本一致,满足应用2-△△ct分析法进行相对定量分析罗非鱼MyD88表达的条件。为验证所建立的荧光实时定量PcR平台,应用相对定量2-△△Ct分析方法初步检测了尼罗罗非鱼肝脏、脾脏、血液和肌肉组织的相对表达量。组织相对定量初步分析结果显示,MyD88基因在参与机体免疫的相关组织肝脏、脾脏和血液中高丰度表达,在肌肉组织中表达量较低。利用所建立的定量检测罗非鱼MyD88表达平台,对健康奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼12种不同组织MyD88表达情况进行分析,分别进行3次生物学重复测定,并用Graphpad Prism5Demo软件进行数据分析。结果显示,MyD88在所有被测组织中均有表达,奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼MyD88各组织表达分布情况基本一致：在卵巢中表达水平最高,其次是小肠、脾脏、肝脏、肾脏、鳃和血液,肌肉、精巢组织中MyD88的表达水平最低。本文对罗非鱼MyD88基因及其表达做了初步研究,推测罗非鱼MyD88功能相似于其他鱼类及哺乳动物,参与机体免疫反应。为进一步开展罗非鱼细菌感染分析以及MyD88与疾病抗性的关系等相关研究提供了基础资料,MyD88和TLR信号转导通路在罗非鱼免疫机制中的如何发挥作用还有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 鱼类天然免疫和其模式识别受体
• 1.1 鱼类天然免疫
• 1.2 模式识别受体
• 1.3 Toll样受体（TLRs）
• 2 髓样分化因子（MyD88）
• 2.1 MyD88基因的发现
• 2.2 MyD88的结构
• 2.3 MyD88的组织分布和表达
• 2.4 MyD88介导的TLRs信号通路
• 2.5 MyD88的生物学功能
• 2.5.1 信号传导通路中的接头蛋白
• 2.5.2 与自身免疫性疾病发生相关
• 2.5.3 与厌食综合症相关
• 3 检测MyD88基因表达研究
• 3.1 检测基因表达的主要方法
• 3.1.1 翻译水平检测方法
• 3.1.2 转录水平检测
• 3.2 实时荧光定量PCR
• 3.2.1 实时定量PCR的原理
• 3.2.2 荧光定量PCR的理论依据
• 3.2.3 荧光定量PCR标记方法及其特点
• 3.2.4 实时定量PCR的类型
• 3.2.5 相对定量PCR方法
• 3.2.6 荧光定量PCR实验操作流程
• 3.3 MyD88基因的表达分析
• 4 罗非鱼介绍
• 5 本研究的目的与技术路线
• 5.1 本研究的目的及意义
• 5.2 本研究的技术路线
• 第二章 罗非鱼MyD88基因的克隆及序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 实验鱼
• 1.2 实验试剂
• 1.2.1 RNA提取相关试剂
• 1.2.2 RT-PCR相关试剂
• 1.2.3 目的片段回收相关试剂
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂
• 1.2.5 DNA Marker
• 1.2.6 培养基
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 RNA提取
• 2.1.1 实验准备
• 2.1.2 罗非鱼肝脏RNA的提取-Trizol法
• 2.2 罗非鱼肝脏cDNA的制备与鉴定
• 2.2.1 cDNA的制备
• 2.2.2 cDNA的鉴定
• 2.3 罗非鱼MyD88基因部分序列的PCR扩增及纯化
• 2.3.1 引物设计及合成
• 2.3.2 中间序列扩增
• 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3.4 PCR产物的回收纯化
• 2.3.5 连接反应
• 2.3.6 感受态的制备
• 2.3.7 转化
• 2.3.8 阳性克隆的筛选
• 2.3.9 阳性克隆的鉴定
• 2.4 罗非鱼MyD88 cDNA全长的获得
• 2.4.1 MyD88序列3'RACE
• 2.4.2 MyD88序列5'RACE
• 2.5 罗非鱼MyD88结构及序列分析
• 3 实验结果
• 3.1 RNA样品的制备与鉴定
• 3.2 cDNA样品的制备与鉴定
• 3.3 罗非鱼MyD88 cDNA部分片段的PCR扩增
• 3.4 罗非鱼MyD88 cDNA3'和5'端的获得
• 3.5 罗非鱼MyD88 cDNA序列分析
• 3.6 罗非鱼MyD88氨基酸同源性及进化分析
• 第三章 罗非鱼MyD88基因荧光定量PCR检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 实验鱼
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 总RNA提取及反转录
• 2.2 MyD88基因定量平台的建立
• 2.2.1 引物的设计
• 2.2.2 扩增效率检测及熔解曲线建立
• 2.2.3 扩增产物的序列验证
• 2.3 平台的初步检测
• 3 结果
• 3.1 扩增结果
• 3.1.1 扩增曲线及熔解曲线分析
• 3.1.2 扩增产物鉴定结果
• 3.1.3 标准曲线的建立
• 3.2 平台的初步检测
• 4 讨论
• 第四章 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼MyD88的表达分析
• 1 材料
• 1.1 实验鱼
• 1.2 试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 罗非鱼各组织RNA的提取及反转录
• 2.2 各组织定量分析
• 3 结果
• 3.1 组织定量结果
• 3.2 MyD88基因组织差异表达分析
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录 实验试剂及配置
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及参与课题