论文摘要
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。该菌的毒力因子有胞外产物包括胞外酶、溶血素、肠毒素、乙酰胆碱酯酶以及粘附素如菌毛和表面蛋白S层等。转座子诱变技术已成功地用于嗜水气单胞菌突变株的构建以研究其毒力基因的功能。 本文研究对象MJ-1即是采用转座子Tn916诱变技术获得的一株多个毒力因子同时缺失的突变株,将其连传20次后,Tn916仍稳定地存在于MJ-1的染色体上。分析MJ-1的生物学特性,与亲本株相比,其胞外蛋白酶（酪蛋白酶和弹性蛋白酶）、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S层等几种主要毒力因子不表达;生化特性表明,MJ-1对部分糖的发酵能力丢失;外膜蛋白图谱、胞外产物图谱发生改变;对HEp-2细胞的粘附性小;对EPC细胞和小白鼠的毒力丢失。MJ-1株同时缺失多种分泌性胞外毒力因子和细胞表面蛋白如S层等,提示嗜水气单胞菌J-1株中可能存在毒力岛。 为确定Tn916的插入位点,采用PCR技术扩增调控胞外蛋白酶分泌的转录调控蛋白（ahyR）全长基因,结果未扩增得到,推测Tn916可能插入到ahyR基因中。进一步采用插入诱变技术构建ahyR基因的突变株以验证Tn916是否插入ahyR基因中。根据GenBank公布的嗜水气单胞菌转录调控蛋白ahyR基因的序列设计一对特异性引物,利用PCR方法扩增Ah J-1株ahyR基因的部分片段（656 bp）。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性（Kmr）基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化Ah J-1株感受态细胞,获得一突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因的同源重组突变株,命名为J-1△ahyR。同时研究了其主要生物学特性。与J-1林相比,J-1△ahyR的胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子的基因不表达;突变株的部分生化特性,外膜蛋白图谱和胞外产物发生改变;对EPC细胞不具有毒力;缺失S层,对HEp-2细胞的粘附性小;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×109CFU,为无致病力菌株。与MJ-1相比,两个突变株的特性基本是相同的,因此确认转座子Tn916插入ahyR基因中。至于是否还有其他插入位点,尚待研究。 采用MJ-1株作为弱毒活疫苗免疫剑尾鱼。将剑尾鱼分成4组,免疫组每尾腹腔注射菌数分别为107CFU、105CFU、103CFU,对照组注射0.1mL无菌PBS,30d后采血测血清凝集抗体效价以及血液中白细胞的吞噬活性,而后用20LD50的Ah强毒株J-1
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相关论文文献
- [1].猪链球菌四环素耐药性与Tn916接合型转座子的关系[J]. 中国人兽共患病学报 2010(12)