论文摘要
研究背景与目的：白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病，居35岁以下人群恶性肿瘤死亡率的首位，其发病率有逐年增高的趋势。虽然在过去几十年里白血病的治疗有了长足进步，但治疗相关的毒副作用和耐药复发严重影响着患者的总体生存率。这就需要我们寻找新的药物去更好的优化治疗方案，减少治疗毒副作用和交叉耐药，提高总体生存率。近十年来，靶向治疗药物的出现为肿瘤治疗提供了新的希望。蛋白酶体抑制剂就是近年来新出现的靶向治疗药物之一，它通过影响调节蛋白的降解从而阻止肿瘤的进程。其中最为人知的二肽硼酸盐硼替佐米，已被证实对多个肿瘤细胞株和裸鼠体内人肿瘤移植模型有效。目前已在美国和欧洲获准上市，用于治疗2个疗程以上的耐药的多发性骨髓瘤患者。在白血病相关的研究中，人们发现多个白血病细胞株和原代白血病细胞中蛋白酶体高表达，硼替佐米单药作用可有效的诱导这些细胞凋亡，当与其他化疗药物联合应用时则存在相加或协同作用。在已结束的临床Ⅰ期研究中发现，单药应用硼替佐米在体内虽具有生物学活性，但临床收效甚微，而联合其他化疗药物使用时，则表现出了较好的治疗效果和耐受性。在我们的前期研究中发现，硼替佐米能够有效地诱导人急性髓系白血病细胞株HL-60凋亡，在与三氧化二砷联合应用时诱导凋亡作用获得显著增强。对初发急性白血病患者原代白血病细胞进行研究，也发现硼替佐米与三氧化二砷联合应用时其诱导凋亡作用比二者单用时明显。为了进一步验证它们在体内的抗白血病效应及其耐受性，我们设计通过HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠模型，观察硼替佐米单药或联合三氧化二砷的体内抗瘤作用和毒性作用，探讨其作用机制，旨在为临床应用提供依据。研究方法：1、采用皮下接种的方法，建立HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠模型。当移植瘤体积长至50～100mm3时，开始分组研究。2、实验分组及用药：依据移植瘤体积大小，将实验裸鼠随机分为4组，即生理盐水对照组：0.2 ml生理盐水，第1至21天；硼替佐米单药组：0.5mg／kg硼替佐米，第1，4，8，11天；三氧化二砷单药组：5mg／kg三氧化二砷，第1至21天；硼替佐米联合三氧化二砷组：0.5mg／kg硼替佐米，第1，4，8，11天，同期5mg／kg三氧化二砷，第1至21天。全部采用腹腔注射给药。3、通过比较实验各组移植瘤生长情况及荷瘤裸鼠生存时间，评估硼替佐米单药或联合三氧化二砷在体内的抗瘤活性。同时观察荷瘤裸鼠对药物的不良反应。4、病理学检查：荷瘤裸鼠在全部用药结束后和临终前，分别取其移植瘤组织做常规病理学检查，观察移植瘤组织的形态学改变。取用药结束后荷瘤裸鼠骨髓，观察有无骨髓抑制和白血病细胞浸润。取临终前荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾组织，观察有无病理改变及瘤转移。5、采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测移植瘤组织的细胞凋亡情况；采用免疫组化法检测移植瘤组织增殖细胞核抗原阳性细胞指数，了解其细胞增殖情况。6、应用SPSS 10.0软件进行数据分析，给药前后及不同用药对荷瘤裸鼠移植瘤体积及体重的影响采用重复测量方差分析，实验各组的移植瘤相对体积及荷瘤裸鼠生存期的比较采用单向方差分析，设定P＜0.05为显著性差异。研究结果：1、用体外培养的HL-60细胞和裸鼠体内传代的HL-60细胞接种，成瘤率分别为20％和53％。移植瘤仅在接种的局部生长，荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓中未见瘤转移。移植瘤组织中，几乎所有的细胞都为髓系的原始细胞，核仁明显，多核比较常见，能看到个别分化的早幼粒细胞。2、移植瘤体积随着时间延长不断增大，给药前后不同时间之间有显著差异（F=330.357，P＜0.001），4个实验组之间也存在显著差异（F=4.200，P=0.030），以联合用药组移植瘤体积增长最慢，其次为两个单药组，而对照组移植瘤体积增长最快。实验各组移植瘤相对体积从给药7天时开始出现显著差异，其中联合用药组的移植瘤相对体积显著小于对照组和硼替佐米单药组，但与三氧化二砷单药组无显著性差异，而三氧化二砷单药组从给药11天时开始其移植瘤相对体积显著低于对照组。各治疗组的抑瘤率分别是：硼替佐米单药组19％，三氧化二砷单药组29％，联合用药组35％。3、实验各组荷瘤裸鼠生存时间存在显著差异（F=4.171，P=0.047），其中三氧化二砷单药组和联合用药组荷瘤裸鼠存活时间显著长于对照组，P值分别为0.036和0.009。各治疗组荷瘤裸鼠生命延长率分别是：硼替佐米单药组12％，三氧化二砷单药组16％，联合用药组22％。4、给药期间，各组荷瘤裸鼠精神状态、活动能力、反应及进食等一般状况未见明显异常，骨髓无抑制。随着时间延长，体重逐渐增加，在给药前后不同时间之间有显著差异（F=76.709，P＜0.001），而实验各组之间无显著差异（F=0.260，P=0.853）。5、用药结束时，各组移植瘤组织病理学检查可见：对照组瘤细胞分布密集，细胞胞体较大，明显异型，核大而深染，胞浆量少，呈嗜碱性，可见个别凋亡细胞及凋亡小体；硼替佐米单药组，瘤细胞分布密度较对照组稍有下降，凋亡细胞和凋亡小体散在分布；三氧化二砷单药组和联合用药组，瘤细胞密度较前两组下降，可见小片状分布的凋亡细胞和凋亡小体。而荷瘤裸鼠终末期移植瘤组织中均为大片坏死组织与瘤细胞交杂，可见散在分布的凋亡细胞和凋亡小体。6、用药结束时，各组移植瘤组织的细胞凋亡指数分别是：对照组4％，硼替佐米单药组11％，三氧化二砷单药组16％，联合用药组25％；增殖细胞核抗原阳性细胞指数分别为：对照组56％，硼替佐米单药组45％，三氧化二砷单药组41％，联合用药组38％。结论：1、在裸鼠皮下接种体外培养的HL-60细胞能够成瘤，但其成瘤率明显低于用裸鼠体内传代HL-60细胞接种的。2、硼替佐米和三氧化二砷单药应用在荷瘤裸鼠体内具有一定的抗瘤活性，当二者联合应用时，其体内抗瘤活性可获得增强。3、硼替佐米与三氧化二砷联合应用，荷瘤裸鼠能较好耐受，无明显毒副作用。4、硼替佐米和三氧化二砷可在体内诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖，且联合应用时作用更明显。