产紫杉醇内生真菌的分离、鉴定及生物学活性实验

论文摘要

从贵州省喀斯特地区生长的数种罗汉松属（Podocrapus）植物中采用组织块法自罗汉松的根、茎、叶等组织中分离到155株内生真菌。其中地上组织的内生真菌种类与地下组织分别占83.87%,16.13%。155株内生真菌经过扩大培养,采用抽提法抽提内生真菌次生代谢产物,通过杯碟法检测其抑菌活性,显示有47株（30.3%）内生真菌有较高的抑菌活性。其中6株（3.87%）内生真菌粗提物在稀释102倍后仍表现出显著抑菌活性;另有5株（3.23%）内生真菌对三种受试菌株均有抗性。同样采用抽提法抽提经过扩大培养155株内生真菌的次生代谢产物,选取Vero、BHK-21细胞应用（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）四唑蓝比色法对抽提内生真菌次生代谢产物的活性进行了分析。结果显示28株内生真菌有较高的抑癌活性。对28株抗肿瘤内生真菌进行的薄层层析（Thin LayerChromatography,TLC）和高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）分析结果证明,菌株A2为罗汉松产紫杉醇内生真菌,将其命名为EPTP-1。对EPTP-1进行了形态学研究,EPTP-1的产孢结构、菌落形态符合曲霉属的分类特征。CTAB法提取EPTP-1菌株全基因组,对其核糖体基因居间序列（ITS）进行Blastn分析,Mega 4.0建系统树后显示与烟曲霉同源性99%。经形态学和分子分类学分析鉴定EPTP-1菌株为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。对EPTP-1在PDB培养基中不同时间段的紫杉醇含量进行测定,结果表明培养第5d EPTP-1产紫杉醇的得率最高,紫杉醇产率为0.5578±0.0294mg/L。将EPTP-1菌株的粗提物进行刮板法纯化紫杉醇得到紫杉醇粗纯品,采用荧光染色法（AO/EB）进行细胞凋亡分析,证实所产紫杉醇的活性与紫杉醇标准品一致;浓度为10μg/L～103μg/L的紫杉醇粗纯品作用24h就有明显的致Vero、BHK-21细胞凋亡作用,细胞膜呈泡状,细胞从瓶壁大量脱落;并且EPTP-1紫杉醇粗纯品的作用剂量和时间与细胞的凋亡率呈线性增加关系,菌株EPTP-1所产紫杉醇具有明显的抑癌作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、前言
• 1 植物内生真菌简述
• 2 国内外分离内生真菌的种类及其生物活性物质
• 3 罗汉松及其亲缘植物
• 4 紫杉醇结构及药理作用机制
• 5 紫杉醇诱导细胞凋亡过程
• 二、研究目的及意义
• 1 研究目的
• 2 研究意义
• 三、材料与方法
• 1 实验样本及试剂
• 2 配制培养基
• 3 配制试剂
• 4 实验仪器
• 5 实验方法
• 四、实验结果
• 1 内生真菌的筛选
• 2 内生真菌EPTP-1种属鉴定
• 3 生物学活性分析
• 五、讨论
• 六、小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录