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猪流感病毒的分离鉴定及NA基因的序列分析

2020-12-07阅读(497)

猪流感病毒的分离鉴定及NA基因的序列分析

论文摘要

猪流感（SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的不同日龄、性别和品种猪的一种群发性呼吸道传染病。迄今为止,SI已遍布美、欧、亚、非等世界各地。猪流感的暴发,对全球养殖业造成了巨大的经济损失。因此,了解SI在我国的流行情况并对其研究,不仅可促进我国畜牧业的健康稳定发展,也是防止人类流感流行的重要环节。本研究从广西各地收集有呼吸症状的鼻粘液、气管粘液和病变肺组织,将经RT-PCR初步检测为阳性的样品,用11日龄鸡胚接种后分离到3株SIV,经HI、RT-PCR鉴定,其中GXHZ株为H1N2亚型毒株,GXLZ、GXXY株为H3N2亚型毒株。然后对分离株进行EID50及GXHZ株的攻毒猪试验研究。结果表明:病毒稀释后接种11日龄鸡胚,不能导致鸡胚的死亡,3株SIV广西分离株GXHZ、GXLZ和GXXY的EID50分别为10-5.3EID50/0.2ml,10-4.7EID50/0.2ml与10-5.5EID50/0.2ml。GXHZ株攻毒猪后没有明显的临床症状,只在第四、五天从采集的猪鼻粘液中重新分离到病毒。用一对特异性引物NA1、NA2经RT-PCR法扩增了分离到的3株SIV的NA基因的cDNA片段,测定核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列与国内外相应序列进行比较。结果表明,所扩增的3株SIV病毒NA基因长度均为1410个核苷酸,共编码469个氨基酸,3个分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性很高,分别达到99.8%以上和99.4以上。3株分离株的NA基因序列与已发表H1N2、H3N2亚型参考毒株的同源性较高,核苷酸同源性分别达到了82.9～98.1%、97.0～99.7,氨基酸同源性分别达到了83.2～98.5%、96.8～99.4。与参考的近年发表毒株EF556202（A/swine/Guangxi/17/05（H1N2））,EF566204（A/swine/Hainan/1/05（H1N2））,EF556200（A/swine/Guangxi/13/06（H1N2））,AF251412（A/Swine/Iowa/533/99（H3N2））比较结果发现,核苷酸的同源性为97.4～99.7%,氨基酸同源性为97.9～99.4%。与古典型参考的代表毒株D00715（A/sw/Hong Kong/3/76（H3N2））,D00716（A/sw/Hong Kong/4/76（H3N2））,AB101674（A/Hong Kong/1/68（H3N2））,CY009302（A/Swine/Colorado/1/77（H3N2））的核苷酸同源性为87.7～91.3%,氨基酸同源性为87.4～91.7%。系统发育分析表明本实验所分离的3个SIV毒株均属于N2亚型,与H1N2亚型毒株亲缘性最相近,特别与中国海南毒株EF566204（A/swine/Hainan/1/05（H1N2））,以及中国广西毒株EF556202（A/swine/Guangxi/17/05（H1N2））与EF556200（A/swine/Guangxi/13/06（H1N2））毒株同源性最高。从时间上也发现,三个分离株的NA基因与1996年以后获得的H3N2毒株亲缘关系很近,都隶属于一个亚分支,但与古典分离株都有较大差异。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一部分 猪流感病毒的研究进展
  • 一 猪流感病毒的病原学
  • 1.1 猪流感病毒的概述
  • 1.2 流感病毒形态结构和化学组成
  • 1.3 SIV的分子特性
  • 1.4 SIV的理化特性
  • 1.5 SIV的生物学特性
  • 二 H3N2猪流感病毒的流行病学研究
  • 2.1 H3N2亚型SIV的发生历史
  • 2.2 H3N2亚型SIV在国外流行情况及调查研究进展
  • 2.3 我国H3N2亚型SIV的流行情况及调查研究进展
  • 三 H1N2猪流感病毒的流行病学研究
  • 第二部分 实验研究
  • 一 猪流感病毒的分离鉴定
  • 1.1 材料与方法
  • 1.1.1 主要材料及试剂的配制
  • 1.1.2 临床样品的收集及处理
  • 1.1.3 临床样品的检测
  • 1.1.4 SIV病毒的分离与增殖
  • 1.1.5 SIV的鉴定
  • 50的测定'>1.1.6 SIV广西分离株EID50的测定
  • 1.1.7 SIV广西分离株的猪感染试验
  • 1.2 结果与分析
  • 1.2.1 SIV的分离
  • 1.2.2 SIV的鉴定
  • 1.2.3 SIV亚型RT-PCR鉴定
  • 50的测定'>1.2.4 SIV广西分离株EID50的测定
  • 1.2.5 SIV广西分离株GXHZ株攻毒观察结果
  • 1.2.6 SIV广西分离株GXHZ株攻毒后病毒分离情况
  • 1.3 讨论
  • 1.3.1 SIV的检测情况分析
  • 1.3.2 SIV的分离情况分析
  • 1.3.3 SIV分离株亚型的分析
  • 50测定分析'>1.3.4 SIV分离株的EID50测定分析
  • 1.3.5 SIV分离株的猪只攻毒试验分析
  • 二 SIV广西分离株NA基因的序列分析
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 主要材料
  • 2.1.2 试剂的配制
  • 2.1.3 NA基因扩增引物
  • 2.1.4 SIV NA全基因序列参考毒株
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 实验路线
  • 2.2.2 实验步骤
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 NA基因的扩增
  • 2.3.2 NA基因重组质粒的鉴定
  • 2.3.3 NA基因cDNA的测序结果鉴定
  • 2.3.4 SIV广西分离株NA基因cDNA序列分析
  • 2.3.5 SIV NA基因同源性分析
  • 2.3.6 SIV NA基因推导氨基酸序列的分析
  • 2.3.7 SIV NA基因序列重要位点的变异分析
  • 2.3.8 SIV NA基因系统发育树的建立
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 SIV遗传演化的重要性
  • 2.4.2 NA基因核苷酸序列及相应氨基酸序列同源性比较
  • 2.4.3 SIV NA基因序列重要位点的分析
  • 2.4.4 SIV NA基因系统进化分析
  • 三 结论
  • 四 附录
  • 4.1 附录一:SIV广西分离株NA基因cDNA推导氨基酸序列
  • 4.2 附录二:SIV NA基因推导氨基酸与国内外毒株的序列比较
  • 4.3 附录三:NA基因进化树
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况

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