论文摘要
研究背景膀胱癌是最常见的泌尿系肿瘤之一。在我国,男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第八位,女性排在第十二位以后。虽然发病率远低于西方国家,但是近年来,我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增高趋势。肌层浸润性膀胱癌极易发生局部浸润或者远处转移,虽然行全膀胱切除和淋巴结清扫术,病人也常常难以治愈,是导致病人死亡的主要原因。目前依然缺乏有效预防和治疗淋巴结或远处器官转移癌的方法,对某些恶性肿瘤的特定器官转移的机制也不明确。膀胱癌远处器官转移的病人不宜手术,故器官转移癌标本难以获取,所以对于肿瘤转移机制和治疗的研究相对滞后。细胞系是用于肿瘤各种机制研究的主要手段,膀胱癌也不例外。目前比较常用的膀胱癌细胞系多数源自国外人群,国人的膀胱癌细胞系并不多见。由于种族差异性的存在,国外人群的膀胱癌细胞系能否完全代表我国人群膀胱癌的类型和特点尚不清楚。器官转移的机制不明确和器官转移癌标本难以获取,导致转移性肿瘤在治疗等方面的研究相对滞后。因此建立国人高恶性度具有多器官转移性膀胱癌细胞系和多器官转移模型对膀胱癌转移机制和治疗的研究有着重要意义。目的通过建立一株中国人的高恶性度、高转移潜能的膀胱癌细胞系,构建出多器官转移性小鼠模型以及初步探讨膀胱癌转移机制,为进一步转移性膀胱癌的研究和诊疗奠定基础。材料和方法膀胱癌细胞系取自一位女性肌层浸润性膀胱尿路上皮癌（术后病理证实为高级别尿路上皮癌T2期）患者。胶原酶消化处理标本,用RPMI1640培养液+10%胎牛血清培养。差异性胰酶消化法进行传代以去除间质细胞。细胞系稳定传代（10代）后,分别取1×106个细胞悬液100μl原位种植于三只裸鼠膀胱。5周后处死小鼠,观察其局部浸润和远处转移情况。取下瘤体后：1.免疫组化法鉴定是否膀胱尿路上皮来源；2.进行体外培养。建立转移器官的细胞系,稳定传代后（10代）再次小鼠膀胱原位种植,成瘤后取各转移灶进行膀胱癌基因和转移相关的机制研究。结果1.3周后细胞系稳定传代,（目前已稳定传代86代）。相差显微镜下观察细胞呈梭形或多边形,未见有明显间质细胞。2.免疫组化验证细胞系是膀胱尿路上皮来源。3.染色体分析发现T921细胞系的核型有着明显异常。4.裸鼠多器官转移模型建立成功,第一次原位种植于三只裸鼠,一只死亡,5周处死,一只出现右侧肾脏转移；另一只有输尿管浸润；其余脏器未发现明显转移灶。取出右肾转移灶,原代培养20代后再次原位种植三只裸鼠出现肾脏。5周后处死,三只均出现多器官转移,如肾上腺、髂淋巴结、腹膜后淋巴结、肝脏、肺门淋巴结等脏器转移。3.膀胱癌转移相关机制研究：①免疫组化提示各转移灶基本不表达P53,明显低于病人膀胱癌组织；增殖相关Ki-67表达量各转移灶较病人标本显著升高；②EMT相关基因E-cadherin和β-catenin在转移过程中出现丢失；③Western blot检钡（?）N—cadherin、Slug、Snail显示发生淋巴结转移的细胞中有显著高表达；肝脏转移、第二次肾脏转移和输尿管浸润细胞与原位瘤比fibronectin表达量未见升高。细胞周期相关蛋白P27在各个转移灶的表达量较原代细胞均有不同成程度降低。⑥④荧光定量PCR检测常见癌基因相关通路关键蛋白提示不同器官转移所通过的通路不完全相同。⑤流式细胞仪检测细胞表面分子CD47在转移细胞系中明显高于原位瘤细胞系和T921细胞系。结论T921膀胱癌细胞系和膀胱癌小鼠多器官转移模型建立成功。初步实验结果提示膀胱癌细胞系的P53的丢失可能是膀胱癌恶性度增加的机制之一。EMT相关基因和转录因子以及膀胱癌常见癌基因表达量的检测提示不同类型器官转移可能有不同机制参与。该细胞系和小鼠多器官转移模型可以用来进一步研究膀胱癌的发生发展和转移机制。以上研究结果提示我们在今后治疗转移性膀胱癌时需考虑不同脏器转移需实用针对其所依赖的通路进行个体化治疗。