乳酸氧化酶的制备及其固定化催化DL-乳酸生产丙酮酸研究

论文摘要

以耻垢分枝杆菌（Mycobacterium Smegmatis AS1.0562）为乳酸氧化酶（Lactate Oxidase，LOD）制备的菌种来源，对其产酶发酵条件、乳酸氧化酶提取工艺、酶学性质及其固定化催化DL-乳酸生产丙酮酸进行了系统的研究。主要研究内容和结果如下：培养基中添加甘油3.0％，蛋白胨0.4％，DL-乳酸1.0％，维生素B10.005％，KH2PO4·H2O 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，硫酸亚铁胺0.01％有助于产酶；优化发酵条件为：250mL三角瓶中装液量50mL，起始pH7.2，培养温度37℃，静置培养4d，乳酸氧化酶平均酶活为65.4U／mL。采用均匀设计法优化了乳酸氧化酶提取工艺，超声波法的最佳工艺条件为：超声功率100W，超声时间8min，磷酸盐缓冲液pH 7.8；冻融法的最佳工艺条件为：冻融次数4次，解冻时间25min，解冻温度37℃，磷酸盐缓冲液pH7.4；在优化工艺条件下，超声波法提取效果要优于冻融法。耻垢分枝杆菌经增菌诱导培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得乳酸氧化酶粗酶液，经30％～70％饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，对其酶学特性进行了研究，该酶的最适反应温度为37℃，反应温度高于65℃时酶蛋白基本上完全变性失活，55℃保温60min酶活保存40％；最适反应pH为7.4，在pH6.5～8.0范围内酶蛋白稳定；低浓度的Na+和Mn2+、Co2+对该酶有激活作用，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Cd2+对该酶有抑制作用；表面活性剂十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温60能增强酶蛋白的热稳定性；酶的动力学分析表明：以DL-乳酸为底物的Km=9.24×10-3mol/L，Vmax=2.42μmol/（min.mg）。采用海藻酸钠包埋、戊二醛交联方法固定化乳酸氧化酶，优化了固定化酶的制备条件，测试了部分酶学性质。1mL酶液和1mL 4％的海藻酸钠溶液混合后，用注射器滴入到20mL 0.2mol/L的GaGl2溶液中，25℃静置固化2h后，过滤洗涤，转移到0.2％戊二醛溶液中25℃交联2h，再经过滤、洗涤和干燥得到球状固定化酶。经固定化后的酶，热稳定性得到显著提高，游离酶在65℃保温1h酶蛋白完全变性失活，而固定化酶在65℃保温1h仍可保持86％的酶活力；其最适酶促反应温度由37℃升至55℃，最适反应pH=7.4保持不变；在不加保护剂的条件下，4℃放置50d后游离酶仅保持40％以上的酶活力，固定化酶能保持80％以上的酶活力。该固定化乳酸氧化酶生物催化DL-乳酸生产丙酮酸，3h后丙酮酸产率可达75％，连续循环使用5个批次固定化酶活力仍保持有85％。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 乳酸氧化酶的来源
• 1.3 乳酸氧化酶的检测方法
• 1.3.1 极谱分析法
• 1.3.2 高效液相色谱法
• 1.3.3 比色法
• 1.3.4 生物传感器法
• 1.4 乳酸氧化酶的催化机理
• 1.5 乳酸氧化酶的分子结构、基因克隆和表达
• 1.6 乳酸氧化酶的提取、分离纯化
• 1.6.1 乳酸氧化酶的提取
• 1.6.2 乳酸氧化酶的分离纯化
• 1.7 酶的固定化及其在生物催化领域的应用
• 1.7.1 酶的固定化技术
• 1.7.2 固定化酶在生物催化领域的应用
• 1.8 立题背景及研究的目的意义
• 1.9 论文的主要研究内容和任务
• 第二章 菌株产酶条件研究
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 试剂配制方法
• 2.3.2 培养和粗酶制备
• 2.3.3 酶活测定方法
• 2.3.4 标准曲线制作方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 菌株生长形态及产酶诱导培养
• 2.4.1 产酶培养基初筛
• 2.4.2 培养基各组分含量实验
• 2.4.3 产酶发酵条件的优化
• 2.5 本章小结
• 第三章 均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验仪器和设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 试剂配制方法
• 3.3.2 培养和实验样品制备
• 3.3.3 酶活测定方法
• 3.3.4 标准曲线制作方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 均匀设计法优化超声波法提取工艺
• 3.4.2 均匀设计法优化冻融法提取工艺
• 3.5 本章小结
• 第四章 乳酸氧化酶粗酶酶学性质研究
• 4.1 实验材料与试剂
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验仪器和设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 试剂配制方法
• 4.3.2 培养和粗酶提取
• 4.3.3 酶液初步纯化
• 4.3.4 透析法脱盐
• 4.3.5 酶活测定方法
• 4.3.6 标准曲线制作方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 硫酸铵最适饱和度的确定
• 4.4.2 最适反应温度的确定
• 4.4.3 热稳定性实验
• 4.4.4 最适反应pH的确定
• 4.4.5 酸、碱稳定性实验
• 4.4.6 表面活性剂对酶热稳定性影响
• +浓度对酶活力影响'>4.4.7 Na⁺浓度对酶活力影响
• 4.4.8 金属离子对酶活力影响
• 4.4.9 最大反应速度和米氏常数
• 4.5 本章小结
• 第五章 固定化乳酸氧化酶催化DL-乳酸生产丙酮酸
• 5.1 实验材料与试剂
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 实验仪器和设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 乳酸氧化酶的制备及其酶活测定方法
• 5.3.2 乳酸氧化酶的固定化
• 5.3.3 固定化乳酸氧化酶催化DL-乳酸产丙酮酸
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 乳酸氧化酶固定化条件的优化
• 5.4.2 固定化酶的酶学性质
• 5.5 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 全文总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 读研期间发表主要论文