用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌侵染过程的基因表达图谱

论文摘要

水稻白叶枯病是由水稻黄单胞细菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的、严重危害世界水稻生产的最重要的细菌病害之一。近十年来,对Xoo致病相关基因的研究,大大增加了人们对其致病机理以及与水稻互作分子基础的认识。虽然已经从Xoo中鉴定出了几十个致病相关基因,但由于Xoo与水稻之间的互作关系以及致病机理比较复杂,许多毒性和无毒机制至今仍不清楚。对Xoo致病机理以及与水稻互作分子过程的解析,将为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。最近公布发表的Xoo全基因组序列,为人们全面和系统地开展Xoo基因组学研究提供了前所未有的机遇。同时,基因芯片技术也是近年来新发展起来的基因组整体研究技术,具有快速、高效和高通量的特点,目前已被广泛地应用于基因表达水平检测等方面的研究,正在逐渐成为植物病原菌致病机理的功能基因组学研究的主要方法之一。 本研究利用基因表达芯片技术,分析了Xoo(菌株JXO I)在与水稻(感病品种日本晴)不同互作条件下的基因表达图谱,鉴别了一批重要的差异性表达的细菌基因。这是有关Xoo一水稻互作及其功能基因学的创新性研究课题之一,至今在国内外尚未见到类似报导。 首先,研制了Xoo的基因芯片。建立了相应的芯片制备技术体系。利用新发表的Xoo以及近似种病菌的全基因组序列,建立了基因组序列本地数据库,选择了Xoo致病相关基因、特有基因、调控因子基因以及植物病原细菌的保守基因,用于基因芯片的构建。成功地研制了一批载有371个Xoo ORFs特异性片段的基因芯片,探索了基因芯片制备过程中的方法要点,建立一套规范的基因芯片制备技术体系。 第二,建立了模拟Xoo侵染水稻初期的体外系统,并成功用于对侵染初期Xoo基因表达图谱的研究。结果表明,与水稻离体叶片互作后15min,Xoo中有hrpXct等50个基因上调表达,有katE等6个基因下调表达。 第三,探索出对发病水稻植株内Xoo进行基因表达图谱分析的方法,获得了Xoo在接种水稻后7d和10d的基因表达图谱。结果表明,Xoo侵染水稻叶片后7d,wxoC等38个基因上调表达,cheR等29个基因下调表达。Xoo侵染水稻叶片后10d,gumG等76个基因上调表达,ygiY等9个基因下调表达。 第四,设计了可覆盖Xoo全基因组的GDPs引物,并用于对接种水稻后1d、3d和7d的Xoo基因表达图谱进行分析。结果表明,Xoo侵染水稻叶片后1d,flhB等43个基因表达上调,tctD

论文目录

• 第一章 绪论
• 1 水稻白叶枯病菌致病性的分子机理
• 1.1 Xoo基因组的总体特征
• 1.2 Xoo与Xac和Xcc的全基因组序列比较
• 1.3 活动组分
• 1.4 代谢特征和RM系统
• 1.5 致病相关基因
• 2 基因芯片的制备技术
• 2.1 基因芯片的种类
• 2.2 芯片点制的表面工艺
• 3 基因芯片在植物—病原物互作研究中的应用
• 3.1 植物抗病反应
• 3.2 应用基因芯片研究植物—病原物互作
• 3.3 芯片数据与已知植物防卫信号途径的相关性
• 4 病原细菌基因表达图谱的研究
• 4.1 医学病原细菌的基因表达谱
• 4.2 植物病原细菌的基因表达谱
• 5 本研究的目的意义及技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 其他试验材料
• 1.4 菌株与植物材料
• 1.5 培养基
• 2 试验方法
• 2.1 芯片的构建
• 2.2 样品的处理与探针的制备
• 2.3 杂交
• 2.4 杂交结果数据分析
• 第三章 结果与分析
• 1 芯片的构建
• 1.1 基因的选择
• 1.2 引物设计
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 Xoo基因芯片制备条件的优化
• 2 样品的处理与探针的制备
• 2.1 不同条件下Xoo总RNA的提取
• 2.2 Xoo全基因组GDP引物的设计
• 3 芯片杂交结果
• 3.1 随机引物标记的结果
• 3.2 GDP引物标记的结果
• 第四章 讨论
• 1 建构Xoo基因芯片及其技术体系的作用和意义
• 2 Xoo与水稻离体叶片互作15min后的基因表达变化
• 3 接种后7d、10d，水稻植株内Xoo基因表达变化
• 4 GDP引物与随机引物标记方法比较
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历