晋A棉花线粒体基因组BAC文库的构建及重要功能基因的筛选

论文摘要

本研究以棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系为研究材料，构建了相应的线粒体基因组细菌人工染色体（BAC）文库，并以线粒体功能基因为探针得到阳性克隆。线粒体基因组文库的构建将为克隆相关基因和研究线粒体基因组结构提供重要的技术平台。其目的是克隆棉花线粒体基因组相关基因，了解棉花线粒体基因组的结构，进而克隆与不育性相关的基因。研究获得以下结果：1．本实验在借鉴了各类作物BAC文库的构建方法后，建立了一套高效的线粒体基因组BAC文库构建的技术体系，包括线粒体的分离、高质量大片段DNA的获得、大量部分酶切最佳条件的确定、片段大小的选择、高效的连接与转化体系等。2．分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。（1）不育系BAC文库的平均插入片段为22.29kb，空载率为0.9％；保持系BAC文库的平均插入片段为21.36kb，空载率为0.8％。据棉花线粒体基因组大小约为700kb计算，两个文库覆盖率分别为线粒体基因组的79和76倍，从理论上筛选出任何一个线粒体基因或序列的概率几乎为100％。（2）插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定繁殖至少100代，无缺失、重组等现象发生，说明BAC克隆的插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定保存。3．根据其它植物线粒体的功能基因设计引物，通过PCR扩增到相应的线粒体功能基因的片段orfB、coxI、atpA、nad4L和atp6，将这些片段分别克隆到pGM-T载体上，进行序列测定和对比确认。4．通过不育系与保持系的orfB，coxI和nad4L3个基因的全序列的比较，证明晋A不育系与保持系在orfB、coxI和nad4L基因全序列上无差异。5．利用棉花的线粒体功能基因或片断：orfB、coxI、atpA、nad4L和atp6对所构建的BAC文库进行菌落原位杂交，均筛选到了阳性克隆。6．对棉花线粒体基因组的几个亚克隆进行序列测定表明：棉花线粒体基因组同样含有重复序列和来源于细胞核基因组叶绿体基因组序列。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 高等植物线粒体基因组（mitochondrial genome）
• 1.1 线粒体的起源
• 1.2 高等植物的线粒体基因组
• 1.3 高等植物线粒体基因组的全序列
• 1.4 植物中不同基因组DNA之间的移动
• 1.4.1 基因逃逸、转移和迁移到细胞核中
• 1.4.2 细胞核和叶绿体基因向线粒体基因的转移
• 1.4.3 被转移基因的激活和表达
• 1.4.4 断裂基因的转移
• 1.5 线粒体与细胞质雄性不育
• 1.5.1 与 CMS相关的线粒体 DNA位点
• 1.5.2 与 CMS相关的嵌合基因常常牵涉到线粒体的功能基因区域
• 1.6 细胞质雄性不育的不育机制
• 1.6.1 毒性假说
• 1.6.2 其它可能的机制
• 1.7 线粒体基因的转录
• 1.8 线粒体基因的编辑
• 1.9 花粉败育的细胞程序性死亡
• 1.10 线粒体基因与细胞核基因之间的相互作用
• 1.11 棉花晋 A细胞质雄性不育系的背景来源
• 1.12 本研究的目的意义
• 第二章 棉花高分子量线粒体 DNA的提取
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验材料的准备
• 2.1.3 高分子量线粒体 DNA的制备
• 2.1.4 胶块的制备
• 2.1.5 胶块质量检测
• 2.1.6 直接裂解线粒体 DNA的制备
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 实验中，采用暗培养的黄化苗提取线粒体 DNA可以减少叶绿体 DNA的污染
• 2.2.2 荧光素染色检测线粒体活性
• 2.2.3 提取的mtDNA的污染率检测
• 2.2.4 提取mtDNA过程中,加入PVP、β-疏基乙醇和BSA有利于提高mtDNA的 产量和质量
• 2.2.5 低熔点琼脂糖包埋法有效地保持了mtDNA的完整性
• 2.3 小结
• 第三章 棉花晋 A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组 BAC文库的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 基因文库评价
• 3.2 结果
• 3.2.1 部分酶切酶最佳用量的确定
• 3.2.2 大量酶切后 DNA片段的选择
• 3.2.3 大片段 DNA的连接和转化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 构建基因文库使用的载体系统
• 3.3.2 插入片段大小的估测和稳定性检测
• 3.3.3 转化效率
• 3.3 小结
• 第四章 棉花细胞质雄性不育系及其保持系的 BAC文库的筛选
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 棉花线粒体功能基因及保守的orf基因片段的获得和地高辛标记
• 4.2.2 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
• 4.3 讨论
• 4.3.1 选择线粒体功能基因作探针
• 4.3.2 线粒体功能基因的单基因同源克隆
• 4.3.3 菌落原位杂交
• 4.3.4 关于 nad4L-orf25基因簇的保守性
• 4.4 小结
• 第五章 棉花线粒体基因组的序列测定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 阳性克隆的酶切、测序
• 5.2.2 棉花线粒体基因组中含有重复序列和外源序列
• 5.3 讨论
• 5.3.1 阳性克隆的酶切测序方法
• 5.3.2 棉花线粒体基因组
• 5.4 小结
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 博士生期间发表的学术论文、专著、重要科研成果
• 博士后期间发表的学术论文、专著、重要科研成果
• 永久通讯方式