论文摘要
昆虫蜕皮激素（Ecdysone）滴度的周期性变化决定了昆虫的生长和发育。蜕皮激素的生理平衡由其自身的合成与降解控制的。近年来,蜕皮激素合成途径的研究已日益清晰,然而关于其降解代谢途径还研究不多。蜕皮激素代谢主要有两种：直接随昆虫的排泄物排出体外：经过进一步的转化形成非活性的形式。Koolman（1989）的研究发现在很多昆虫体内,尤其是鳞翅目昆虫,蜕皮激素主要以3-脱氢蜕皮激素（3-dehydroecdysone,3DE）的形式存在。3DE只有很微弱的蜕皮激素活性,因此被认为是昆虫蜕皮激素代谢的一种主要方式。蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶（ecdysone oxidase）的作用下转化成3DE,紧接着3DE在依赖NAD（P）H的3-脱氢蜕皮激素-3α还原酶（3-dehydroecdysone-3α-reductase）的不可逆的催化作用下生成3-异构蜕皮激素（3-epiecdysteroid）。另一方面,血淋巴中的3DE在依赖NAD（P）H的3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶（3-dehydroecdysone-3β-reductase）的催化下生成蜕皮激素。前胸腺是昆虫分泌蜕皮激素及3DE的主要器官,之前研究发现3DE与蜕皮激素的比例在不同物种中有很大的差异,而3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶作为3DE与蜕皮激素相互转化的酶之一,它对昆虫蜕皮激素滴度的变化可能也起着重要的作用。随着该途径的发现,3-脱氢蜕皮激素-3β还原酶也从海灰翅夜蛾{Spodoptera littoralis)以及粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）中纯化出来。早在1996年,家蚕的3-dehydroecdysone-3β-reductase就从幼虫的血淋巴中经过六步的纯化得到的,并且在体外分析得到了该酶的酶促动力学参数。然而,至今该基因仍未被鉴定出。家蚕在作为一种鳞翅目模式昆虫,开始逐步成为基因功能研究的理想材料。随着家蚕基因组和基因芯片数据的公布,也为研究家蚕基因提供了极好的信息平台。本研究在家蚕基因组数据库的基础上,对影响家蚕蜕皮激素形成途径中的基因家蚕3-dehydroecdysone-3β-reductase基因进行了深入系统的研究。主要研究结果如下：1、基因的生物信息学分析基于NCBI和家蚕基因组数据库,对家蚕Bm3DE-3β-reductase基因进行了生物信息学分析,该基因全长1032 bp,包括8个外显子和7个内含子,编码343个氨基酸,预测蛋白的分子量为39 kDa,等电点（PI）为5.69,位于家蚕第2号染色体的nscaf 2053上。经蛋白质结构域分析发现,家蚕（Bm3 DE-3β-reductase）与粉纹夜蛾（Tn-3DE-3β-reductase）,海灰翅夜蛾（Sl-3DE-3β-reductase）等物种均含有aldo-keto结构域。进化分析表明,Bm3DE-3β-reductase基因与鳞翅目中其他昆虫3DE-3β-reductase基因的进化关系较近。2、家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的表达特征分析RT-PCR表达分析可知,Bm3DE-3β-reductase基因从5龄1天时表达量很低,而到达幼虫5龄7天和上蔟开始时表达最大,上蔟24h之后几乎不表达。Bm3DE-3β-reductase在5龄的表达模式与家蚕的蜕皮时间比较一致,在组织层面上,Bm3DE-3β-reductase基因在头部,表皮,脂肪体,卵巢表达很高,在血淋巴中表达次之。3、家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的原核表达与多克隆抗体制备将Bm3DE-3β-reductase基因中编码第22至343个氨基酸残基的成熟肽基因片段亚克隆至PGEX-4T-1原核表达载体,转化BL21（DE3）诱导表达,并经GST亲和层析纯化靶蛋白,以此为抗原用小鼠制备了抗家蚕Bm3DE-3β-reductase I的多克隆抗体。Western blotting检测原核表达的靶蛋白,表明融合蛋白具有家蚕Bm3DE-3β-reductase的抗原性,抗体免疫特异性较高。4、家蚕Bm3DE-3β-reductase的组织定位利用western blotting检钡Bm3DE-3β-reductase基因在蛋白质水平的组织分布情况,结果发现在家蚕脂肪体和血细胞中有很高的表达。进一步,我们通过免疫组化的方法,在这两个组织中探测到了很强的信号,证实了其表达情况。4.家蚕Bm3DE-3β-reductase基因的真核表达及功能鉴定将Bm3DE-3β-reductase基因中编码第22至343个氨基酸残基的成熟肽基因片段亚克隆至pPIC9K真核表达载体,将重组载体转入酵母X-33中,甲醇诱导表达。Western blotting检测证明目的基因能够在酵母中进行表达。我们利用酵母的表达上清进行功能反应,并用高效液相色谱检测产物的生成,但由于现有底物的问题,其活性的鉴定还需进一步研究。