论文摘要
目的：观察四种骨质疏松治疗药物（维生素K2、甲状旁腺激素、活性维生素D3、阿伦膦酸钠）对体外培养SD大鼠成骨细胞基质gla蛋白（MGP） mRNA表达的影响,探讨MGP在骨质疏松发病中的可能作用。方法：1.采用胰酶-胶原酶序贯消化法获得新生1-3天内SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养。2.取第二代细胞经Ⅰ型胶原、ALP、矿化结节染色进行成骨细胞表型鉴定。3.取第四代成骨细胞,分别给予不同浓度的维生素K2、甲状旁腺激素（PTH）、活性维生素D3、阿伦膦酸钠干预培养24h：维生素K2（10-7、10-6、10-5mol/L）, PTH （1-34） （10-9、10-8、10-7mol/L）,活性维生素D3（10-10、10-9、10-8mol/L）,阿伦膦酸钠（10-6、10-5、10-44mol/L）,每种药物均设立空白对照。4.培养24h后抽提成骨细胞总RNA,采用荧光实时定量RT-PCR检测成骨细胞MGP mRNA表达的变化。结果：1.原代成骨细胞形态学观察：经胰酶-胶原酶序贯消化法获得的颅骨骨片贴壁后7-10天细胞从骨片爬出,5-6天后许多组织块爬出的细胞已汇合成单层甚至呈重叠生长,7-8天后细胞生长达到高峰。2.成骨细胞的表型鉴定：①Ⅰ型胶原染色：Van Gieson苦味酸酸性复红染色呈棕红色,说明细胞有合成基质蛋白的功能。②ALP染色：用改良的钙钻法（Gomori法）染色显示细胞内棕黑细微颗粒,说明细胞ALP活性增高,细胞骨基质的成熟。③矿化结节染色：原代SD大鼠成骨细胞在β-甘油磷酸钠存在的情况下培养1月,可形成矿化结节。3.维生素K2、PTH（1-34）、活性维生素D3、阿伦膦酸钠对成骨细胞MGP mRNA表达的影响：①维生素K2上调成骨细胞MGP mRNA的表达,浓度为10-5mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量是空白对照组的2.56倍,浓度为10-7mol/L和10-6mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是对照组的1.57倍和2.12倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。②PTH （1-34）上调成骨细胞MGP mRNA的表达,浓度为10-7mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量是空白对照组的6.78倍,浓度为10-9mol/L和10-8mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是对照组的2.23倍和5.31倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。③活性维生素D3上调成骨细胞MGPmRNA的表达,浓度为10-8mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量是空白对照组的8.93倍,浓度为10-10mol/L和10"9mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是对照组的3.47倍和6.95倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。④阿伦膦酸钠上调成骨细胞MGP mRNA的表达,浓度为10-44mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量是空白对照组的3.47倍,浓度为10-6mol/L和10-5mol/L时成骨细胞MGP mRNA的表达量分别是对照组的1.98倍和2.49倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：荧光实时定量RT-PCR技术证实MGP在原代培养SD大鼠成骨细胞中有表达。骨质疏松治疗药物维生素K2、PTH、活性维生素D3、阿伦膦酸钠均可促进原代培养SD大鼠成骨细胞MGP mRNA的表达,且呈浓度依赖性。MGP可能为骨质疏松治疗药物作用的靶点,参与了骨质疏松的发病。
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