论文题目: 三种经济植物遗传多样性的ISSR和RAPD分析、fad基因克隆和农杆菌介导的遗传转化
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物细胞工程
作者: 周延清
导师: 贾敬芬
关键词: 经济植物,油酰基去饱和酶基因,遗传多样性,农杆菌介导的遗传转化
文献来源: 西北大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本文旨在:Ⅰ.建立河南三种主栽经济植物地黄、山药和大豆种质遗传多样性的ISSR和RAPD标记分析体系,为利用DNA分子标记技术合理利用、保护、鉴定和改良这三种植物品种提供理论和技术依据。Ⅱ.建立发根农杆菌对怀地黄的转化及毛状根的植株再生体系。Ⅲ.分离克隆大豆油酰基-△12-去饱和酶基因fad 2-1和构建反义基因表达载体,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育大豆和怀地黄新品种提供理论和技术依据。 Ⅰ.利用ISSR和RAPD标记技术对这三种经济植物种质遗传多样性进行了检测。其中,ISSR标记技术首次用于这一研究。所取得的主要进展如下:（1）.用CTAB法提取了10个地黄品种、28个山药品种和10个大豆品种以及16个怀地黄单株的基因组DNA,建立了适用于山药基因组DNA提取的改良CTAB方法。（2）.以怀地黄基因组DNA为模板,优化出了适宜于地黄ISSR分析的合适的退火温度（53-55℃）和扩增体系:25μL PCR反应体积,包含1×Taq DNA酶缓冲液（10mmol/L Tris-HC l,50mmol/L KCl,0.1%Trion X-100,pH9.0）,2.5 mmol/L MgCl2,1.0-1.5U Taq酶,60ng模板DNA,0.4μmmol/L引物,dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.4 mmol/L。（3）.在此基础上,从44个ISSR引物中分别筛选出了适合于地黄、山药和大豆ISSR标记分析的引物10条、7条和8条;从80条RAPD引物中分别筛选出了适合于地黄和山药RAPD标记分析的引物17条和2条。（4）.10条ISSR引物对10个地黄品种（系）扩增出110条带,多态条带比率（PPB）为71.82%,平均多样性指数（Ⅰ）为0.3577,遗传相似系数（GS）在0.557～0.979,平均GS为0.665;17条RAPD引物对10个地黄品种（系）扩增出177条带,多态条带比率（PPB）为61.58%,平均多样性指数（Ⅰ）为0.3135,遗传相似系数（GS）在0.63～0.93,平均GS为0.7545。两种分子标记的分析结果呈极显著正相关（r=0.649）;利用2条ISSR引物对16个怀地黄单株扩增出17条带,多态条带比率（PPB）为64.71%。使用3条RAPD引物对16个怀地黄单株扩增出7条带,多态条带比率（PPB）为57.14%。（5）.7条ISSR引物对28个山药品种扩增出65条带,多态条带比率（PPB）为83.01%,平均多样性指数（Ⅰ）为0.4379,遗传相似系数（GS）在0.33～0.96,平均GS为0.6246。2条RAPD引物对28个山药品种扩增出23条带,多态条带比率（PPB）,为82.6%。（6）.8个ISSR引物对10个大豆品种扩增出89条带,多态条
论文目录:
摘要
Abstract
目录
第一章 地黄、山药和大豆遗传多样性的ISSR和RAPD分析
第一节 绪论
1 植物DNA分子标记技术概述
1．1 遗传标记及其类型
1．2 DNA分子标记的建立和发展
1．3 DNA分子标记的特点
1．4 DNA分子标记技术类型
2 RAPD标记技术
2．1 RAPD标记技术的概念和原理
2．2 RAPD标记技术的特点
2．3 RAPD标记技术操作
2．4 PAPD标记技术在植物学研究中的应用
2．4．1 遗传图谱的构建
2．4．2 系统进化发育
2．4．3 基因定位
2．4．4 在植物分子标记辅助育种选择中的应用
2．4．5 作物品种鉴定和杂交种纯度鉴定
2．4．6 体细胞杂种的鉴定
2．4．7 性别鉴定
3 ISSR标记技术
3．1 ISSR标记技术概述
3．2 ISSR标记技术的原理
3．3 ISSR标记技术的特点
3．4 ISSR标记技术的操作步骤
3．5 ISSR标记技术的应用
3．5．1 遗传连锁图谱的构建
3．5．2 基因定位
3．5．3 种质资源鉴定
3．5．4 植物亲缘关系分析
第二节 地黄、山药和大豆遗传多样性的RAPD与ISSR分析
1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义
1．1 地黄
1．2 山药
1．3 大豆
2 实验材料
2．1 地黄幼叶
2．2 山药幼叶
2．3 大豆下胚轴
3 实验方法
3．1 基因组DNA的提取、纯化和检测
3．1．1 地黄基因组 DNA的提取、纯化和检测
3．1．2 山药基因组 DNA的提取、纯化和检测
3．1．3 大豆基因组 DNA的提取、纯化和检测
3．2 ISSR标记和RAPD标记及其产物检测
3．2．1 地黄ISSR标记和RAPD标记及其产物检测
3．2．2 山药ISSR标记和RAPD标记及其产物检测
3．2．3 大豆ISSR标记及其产物检测
3．3 数据统计与分析
4 结果和分析
4．1 基因组 DNA的提取与检测
4．2 ISSR-PCR扩增产物的多态性
4．2．1 地黄ISSR-PCR扩增产物的多态性
4．2．2 山药ISSR-PCR扩增产物的多态性
4．2．3 大豆ISSR-PCR扩增产物的多态性
4．3 ISSR聚类分析
4．3．1 地黄品种间的ISSR聚类分析
4．3．2 山药品种间的ISSR聚类分析
4．3．3 大豆品种间的ISSR聚类分析
4．4 基于ISSR标记的主成分分析
4．4．1 地黄品种基于ISSR标记的主成分分析
4．4．2 山药品种基于ISSR标记的主成分分析
4．4．3 大豆品种基于ISSR标记的主成分分析
4．5 RAPD-PCR扩增产物的多态性
4．5．1 地黄RAPD-PCR扩增产物的多态性
4．5．2 山药RAPD-PCR扩增产物的多态性
4．6 地黄品种间的RAPD聚类分析
4．7 地黄RAPD和ISSR标记的相关分析
5 讨论
5．1 三种植物基因组 DNA的提取方法及其改良
5．2 三种植物遗传多样性评价
5．3 地黄遗传相似性评价
5．4 反应体系的稳定性和可重复性
5．5 一些值得注意的实验技术问题及其解决方法
第二章 农杆菌介导的怀地黄和大豆遗传转化
第一节 农杆菌介导的遗传转化研究进展
1 农杆菌转化系统
2 农杆菌及其质粒
3 农杆菌转化植物细胞的机理
4 农杆菌载体系统
5 农杆菌转化系统的优缺点
5．1 农杆菌转化系统的优点
5．2 农杆菌转化系统的缺点
6 影响转基因表达的主要因素
7 农杆菌介导的植物遗传转化应用
第二节 发根农杆菌对怀地黄的转化及毛状根的植株再生
1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义
2 实验材料
2．1 植物材料
2．2 发根农杆菌菌株
3 实验方法
3．1 无菌外植体的获得
3．2 发根农杆菌菌株菌液的制备
3．3 转化试验
3．3．1 不同菌株对叶片转化率的影响
3．3．2 不同外植体对转化率的影响
3．4 毛状根离体培养系的建立
3．5 毛状根的鉴定
3．5．1 PCR检测
3．5．2 冠瘿碱检测
3．6 不同培养基对毛状根生长的影响
3．7 不同培养方法对毛状根生长的影响
3．8 不同蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响
3．9 HPLC测定梓醇
3．9．1 对照标准品溶液的制备
3．9．2 样品溶液的制备
3．9．3 测定条件
3．10 愈伤组织的诱导
3．11 6-BA和GA_3对愈伤组织分化芽的影响
3．12 GA_3、KT和6-BA对毛状根直接分化芽的影响
3．13 生根和转化植物的鉴定
3．14 再生转化植株形态、气孔和叶绿体观擦
3．15 移栽
4 实验结果
4．1 怀地黄85-5芽的快速繁殖
4．2 不同菌株对叶外植体毛状根诱导率的影响
4．3 不同外植体对毛状根诱导率的影响
4．4 毛状根克隆系的建立
4．5 毛状根的PCR检测
4．6 毛状根冠瘿碱的检测
4．7 不同培养基对毛状根生长的影响
4．8 不同培养方法对毛状根生长的影响
4．9 蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响
4．9．1 回归方程的建立和相关系数的计算
4．9．2 鲜地黄、生地黄和组培苗根的梓醇含量
4．9．3 蔗糖浓度对毛状根生长和梓醇生成的影响结果
4．10 2，4-D和6-BA组合对毛状根愈伤组织诱导的影响作用
4．11 植物生长调节剂对毛状根分化芽的影响
4．11．1 GA_3和6-BA组合对毛状根愈伤组织分化芽的影响作用
4．11．2 GA_3、KT和6-BA组合对毛状根直接分化芽的影响作用
4．12 转化芽生根
4．13 再生转化植株的鉴定
4．13．1 PCR检测
4．13．2 冠瘿碱检测
4．14 再生转化植株的形态观察
4．15 气孔和叶绿体观察
4．16 移栽
5 讨论
5．1 怀地黄毛状根的诱导和鉴定
5．2 影响发根农杆菌转化植物细胞的因素
5．3 rol基因与植物激素互作影响植物细胞分化和植株再生
5．4 毛状根及其产生的组织、器官和植物的鉴定方法
第三节 大豆fad基因片段的克隆及其对根癌农杆菌的转化
1 研究中存在的主要问题、本研究内容、目的和意义
2 实验材料
2．1 植物材料
2．2 载体、菌株与抗生素
2．3 试剂
2．3．1 酶及试剂盒
2．3．2 DNA提取所用溶液
2．3．3 根癌农杆菌质粒提取的试剂
2．3．4 LB培养基
2．3．5 YEB培养基
3 实验方法
3．1 总DNA的提取
3．2 PCR方法分离fad2-1基因片段
3．2．1 引物的设计
3．2．2 PCR扩增
3．2．3 PCR产物的纯化
3．3 大肠杆菌转化和转化子鉴定
3．3．1 连接
3．3．2 大肠杆菌感受态细胞制备
3．3．3 转化E．coli JM109
3．3．4 大肠杆菌质粒DNA的提取
3．3．5 大肠杆菌转化子酶切鉴定
3．3．6 大肠杆菌转化子PCR鉴定
3．4 DNA序列测定和分析
3．5 反义基因表达载体的构建
3．6 根癌农杆菌转化和转化子鉴定
3．6．1 反义表达载体pbt-pfad质粒的提取及纯化
3．6．2 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备
3．6．3 转化
3．6．4 根癌农杆菌质粒的提取
3．6．5 根癌农杆菌转化子的双酶切鉴定
3．6．6 质粒的PCR检测
4 实验结果
4．1 总DNA的提取
4．2 目的基因的克隆
4．3 重组质粒的PCR检测和酶切检测
4．4 大豆fad2-1基因部分序列的测定及分析
4．5 植物反义表达载体的构建及酶切和PCR检测
4．6 根癌农杆菌转化子鉴定
5 讨论
5．1 PCR法克隆大豆油脂酰-△-12去饱和酶基因fad2-1
5．2 反义fad2-1基因片段表达载体的构建
5．3 选定合适的克隆载体
5．4 质粒DNA的质量和纯度影响根癌农杆菌LBA4404转化
结论
本研究的创新点
研究有待进一步解决的问题
参考文献
攻读博士学位期间科研成果和奖励
附件
致谢
发布时间: 2005-11-18
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