PtIAA1和PtABP1基因的克隆及其在杨树中的表达

论文摘要

木材形成是一个受到基因编码严格调控的复杂的生物学过程。若通过分子育种技术来改良木材品质，需首先深入了解木材形成过程的分子机制，即研究控制木材形成的关键基因及其相互作用机制，以实现有目的地进行分子育种设计，最终达到调控木材形成、改良木材品质的目的。生长素在形成层活动和维管组织分化中起着极其重要的调控作用，包括：控制形成层活动周期，维持纺锤状细胞的形态和排列方向，控制木质部和韧皮部的分化。先前在模式植物拟南芥中的研究初步表明，生长素结合蛋白（Auxin Binding Protein，ABP）和生长素响应蛋白（Auxin Response Protein，ARP）可通过调控生长素的转运来实现有效控制木材维管系统发育和分化。为了研究在木本植物中生长素与形成层活动和次生维管组织形成的关系，本研究利用RT-PCR方法，克隆了2个与生长素信号转导密切相关的基因，通过组织特异性表达分析和基因工程技术来研究这2个基因在杨树中的表达模式，初步揭示了其对形成层活动和次生维管组织的影响。得到如下主要结论： 1．Aux／IAA基因在生长素信号转导系统中具有重要作用。利用RT-PCR方法，首次从毛白杨形成层cDNA中分离出PtIAA1cDNA，并进行了测序和序列分析。结果表明，克隆的毛白杨PtIAA1 cDNA片段总长为764 bp，基因内部含有完整的开放阅读框架，大小为606 bp，可编码长度为201个氨基酸残基的蛋白质。在此基础上，利用RT-PCR方法，研究了其组织特异表达模式，发现该基因在形成层区域表达量最高，未成熟木质部次之，成熟木质部较低，在根部表达丰度很低，而在韧皮部中则几乎没有检测到PtIAA1基因的表达。为了研究PtIAA1基因对形成层活动和次生维管组织形成的影响，以pBI121为载体，分别构建了该基因的正、反义表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法，将构建好的基因导入杨树中，经PCR检测和Southern杂交实验表明，本研究得到了该基因的正、反义杨树转化植株。定量PCR检测显示，该基因在转化和野生型植株中表达有明显差异。在此基础上，通过表型观察，发现PtIAA1正义转化植株的高生长明显低于对照植株，且地径小于对照植株。相反PtIAA1反义转化植株的地径明显大于对照植株，而且茎发生严重弯曲。对杨树茎横切面进行切片观察发现，PtIAA1反义转化植株形成层区域明显变宽，而正义转基因植株则变窄，初步表明PtIAA1可能参与了形成层细胞的分裂和分化。 2．ABP1是可能的生长素受体，在植物生长发育过程中有着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 引言
• 1.1 木材形成的生物学过程
• 1.1.1 维管形成层的起源和结构
• 1.1.2 次生壁的形成
• 1.1.3 细胞程序化死亡
• 1.2 生长素和植物发育
• 1.2.1 生长素的生物合成
• 1.2.2 生长素的代谢
• 1.2.3 生长素极性运输
• 1.2.4 生长素信号转导
• 1.2.4 生长素信号传导模型
• 1.2.5 生长素在胚胎发育和形态建成中的作用
• 1.2.6 生长素在木材形成过程中的作用
• 1.2.7 维管分化的分子调控
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 本研究的技术路线
• 2 毛白杨PtIAA1基因的克隆及在杨树中的表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料及其来源
• 2.2.2 杨树基因组DNA提取
• 2.2.3 RNA提取和cDNA的合成
• 2.2.4 RT-PCR扩增目的基因
• 2.2.5 目的片段的亚克隆
• 2.2.6 序列分析
• 2.2.7 组织特异性表达分析
• 2.2.8 植物表达载体的构建及农杆菌转化
• 2.2.9 目的基因的转化
• 2.2.10 转基因植株的PCR检测
• 2.2.11 转基因植株的Southern检测
• 2.2.12 定量PCR检测目的基因的表达
• 2.2.13 转基因植株解剖结构分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 毛白杨PtIAA1基因的克隆及其序列分析
• 2.3.2 PtIAA1基因的组织表达谱分析
• 2.3.3 植物表达载体的构建及植物转化
• 2.3.4 转化植株的PCR检测
• 2.3.5 转基因植株Southern杂交检测
• 2.3.6 转基因杨树定量PCR检测
• 2.3.7 转基因杨树表型及解剖结构分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 PtIAA1基因的克隆
• 2.4.2 PtIAA1基因的组织差异性表达分析
• 2.4.3 PtIAA1基因转化研究
• 3 毛白杨PtABP1基因的克隆及在杨树中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.2.1 试验材料及其来源
• 3.2.2 杨树基因组 DNA提取
• 3.2.3 RNA提取和cDNA合成
• 3.2.4 RT-PCR扩增目的基因
• 3.2.5 目的片段的亚克隆
• 3.2.6 序列分析
• 3.2.7 PtABP1基因表达的mRNA原位杂交定位
• 3.2.8 PtABP1基因表达的mRNA原位RT-PCR定位
• 3.2.9 植物表达载体构建及农杆菌转化
• 3.2.10 目的基因转化
• 3.2.11 转基因植株的PCR检测
• 3.2.12 转基因植株的Southern杂交检测
• 3.2.13 转基因植株的定量 PCR检测
• 3.2.14 转基因植株解剖结构分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 毛白杨PtABP1基因的克隆及其序列分析
• 3.3.2 原位杂交分析PtABP1在杨树茎中的表达情况
• 3.3.3 原位RT-PCR分析PtABP1在杨树茎中的表达情况
• 3.3.4 植物表达载体的构建及植物转化
• 3.3.5 转化植株的 PCR检测
• 3.3.6 PtABP1转基因植株的Southern杂交检测分析
• 3.3.7 转基因杨树定量 PCR检测
• 3.3.8 转基因杨树的解剖结构分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PtABP1基因的克隆
• 3.4.2 PtABP1基因的组织定位研究
• 3.4.3 ABP1转基因研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录一