生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究

论文摘要

本博士学位论文工作的主要贡献为：在蛋白质组学领域中关于低丰度蛋白和多肽除盐、富集的研究方面取得了创新性的进展：利用液滴内部的“Outward Flow”过程结合自制的多功能疏水性聚合物成功实现了一步高效靶上除盐与样品富集直接MALDI-MS分析，并成功应用到实际样品的蛋白质组学研究中；同时利用上述体系，使用阳离子型聚合物成功实现了对低丰度磷酸化肽段的靶上富集与除盐；首次利用聚合物-无机纳米复合材料成功实现了低丰度蛋白质／多肽的高效、快速和高回收率富集；参与研制成功了作为高效液相色谱检测器的电喷雾—四极杆—飞行时间质谱仪（ESI-Q-TOF-MS），填补了国内空白。蛋白质组学作为后基因组时代生命科学领域的热点，近年来得到了蓬勃的发展，已涉足生命科学中一系列前沿领域，并成为分析化学研究领域的最前沿课题。它的内容包括分离和分析细胞与组织的全部蛋白并直接找到一组或几组功能蛋白，研究它们与功能基因（组）的内在联系。蛋白质组研究具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势，更接近生命现象的本质，在药靶研究中具有潜在价值，可通过对蛋白质性质、丰度的考察来揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白，使之成为诊断、治疗及药物筛选的靶分子。目前蛋白质组已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律，并取得了很多重大的成就。蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于生物质谱技术的飞速发展以及高通量分离和分析技术的突破性进步。首先是质谱技术尤其是“软电离源”技术——电喷雾和基质辅助激光解析离子源的发展，使之成为检测微量甚至是痕量蛋白质分子的重要手段。高通量、高效的分离技术和大规模、高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞乃至亚细胞中的全部蛋白质以及利用稳定同位素标记方式与多维分离-串级质谱实现大规模的蛋白质定量分析也已经使得生物质谱成为实现这一目标的核心分析技术。生物信息学的建立形成了国际性的科学大协作。目前，世界各主要国家都不惜巨资进行蛋白质组的研究。蛋白质组学研究的进一步深入，将对了解疾病的发生和药物的筛选起到决定性的作用。本博士学位论文工作主要是在化学系生物质谱实验室和生物医学研究院蛋白质组学研究中心完成的。由于传统的生物质谱技术平台已不足以应对蛋白质组学中低丰度蛋白检测的要求，所以研究和发展针对低丰度蛋白检测方面的新技术与新方法尤显得意义重大，本论文以此为切入点，研究了蛋白质组学分析中如何实现低丰度蛋白有效富集和除盐的问题，包括：利用疏水性聚合物微印迹技术实现的靶上一步除盐和样品富集技术；开展了靶上磷酸化肽段直接浓缩与除盐技术的研究；发展了利用聚合物-无机纳米复合材料实现的低丰度蛋白快速高效富集技术。又因为串级质谱的成功鉴定对于蛋白质组学研究也非常重要，所以本论文以一种含有多达28个氨基酸的复杂多肽为对象研究了如何对大质量多肽进行有效的串级质谱全序列分析；本论文作者还参与研制成功了作为高效液相色谱检测器的高分辩飞行时间质谱仪。本论文共分六章，主要内容摘要如下：第一章主要综述了蛋白质组学研究中的关键技术——生物质谱相关技术的发展及其在蛋白质组学中的应用。新的“软电离”方式——基质辅助激光解吸电离技术（MALDI）和电喷雾电离技术（ESI）的问世、质谱质量分析器的改善、各种分离技术如高效液相色谱／毛细管电泳等和质谱的联用、稳定同位素标记技术的发展及应用，使得生物质谱已成为蛋白质组学研究中无可替代的核心技术平台。生物质谱在对基因工程产物、功能蛋白及疾病相关蛋白的定性、定量分析中具有无可比拟的优越性，在蛋白的相互作用、蛋白质的折叠等动力学过程的研究中具有极大的潜力。而蛋白质组学作为一门新兴学科，它的发展现状和最新技术进展还包括双向凝胶电泳技术、色谱分离技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术等。低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一，在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，因此低丰度蛋白的有效浓缩与除盐是实现其准确分析和鉴定的重要条件，所以本章还综述了目前针对低丰度蛋白检测的技术，并提出了本课题工作的研究方向。第二章研究工作主要涉及关于低丰度蛋白靶上一步除盐与富集直接MALDI-MS分析的新方法。这部分工作是通过将疏水性聚合物微印迹技术与基质辅助激光解析离子化质谱联用，巧妙利用液滴内部的“Outward Flow”效应，结合自制的多功能疏水性聚合物成功实现了痕量多肽的靶上一步除盐与富集。微印迹的疏水性聚合物对蛋白质和多肽有很好的吸附富集效果，但是对无机盐和其他污染物吸附很少，利用固体表面液珠蒸发过程中的外流作用，被疏水性聚合物吸附的样品无需额外的洗脱除盐步骤就可实现一步除盐并可直接进行MALDI-TOF-MS分析。本方法不仅成功实现了样品一步除盐与富集的特性，而且具有灵敏度高、重现性高、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点。可广泛用于蛋白质组学领域，大大拓展了疏水性聚合物的应用范围。此工作已显现出比传统商业Ziptip或ZipPlate除盐、富集系统更优秀的特性，并成功应用在我们课题组承担的国际人类蛋白质组人肝计划和中国人肝计划。第三章主要阐述了低丰度磷酸化肽段靶上浓缩与除盐—直接MALDI-MS分析的研究。蛋白质的翻译后修饰是目前蛋白质组研究中的一个重要课题，目前蛋白质组技术研究的主要目标之一是建立一套能快速、有效、高通量地分析鉴定发生翻译后修饰的蛋白质的方法技术。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生等。目前蛋白质组学方法中磷酸化蛋白、肽段的富集技术主要包括双向磷酸多肽谱图法、高分辨率的凝胶电泳法（2DE）、反相高效液相色谱法、固定化金属亲和色谱（IMAC）、抗体富集、化学标记富集等。磷酸化肽段的质谱检测难点主要在于其丰度低、动态的体内磷酸化过程、难于离子化、受其它高丰度的非磷酸化肽段信号的强烈抑制等原因。本论文采用一种阳离子性聚合物材料，结合第二章介绍的一步除盐与样品富集体系，在靶上有效富集了低浓度磷酸化肽段，大大简化了样品富集步骤。本方法可检测到10fmol／μL β-酪蛋白中的单磷酸化肽，并可得到很好的串级质谱信息。第四章研究工作主要涉及一种以纳米碳酸钙球表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯组合材料（简称CaCO3-PMMA）作为纳米吸附剂，进行痕量肽及蛋白样品的富集——伴随无固态颗粒化基质辅助激光解析离子源质谱直接分析的方法。此聚合物-无机纳米复合材料可对蛋白质和多肽进行快速高效富集，与基质辅助激光解吸离子源质谱有很好的相容性，吸附了样品的CaCO3-PMMA在进入质谱分析前被巧妙的去核——从而避免固体颗粒对信号重现性的影响及其溅射对质谱仪器的损害。本方法操作简单，快速高效，既避免了常规吹干富集方法的样品损失问题，又具有很好的耐盐性。本方法可广泛适用于蛋白质组学相关领域，并大大拓展了聚合物-无机纳米复合材料CaCO3-PMMA的应用范围。第五章主要介绍了对含有28个氨基酸的复杂多肽的串级质谱全序列分析研究。对于含有太多氨基酸片断（大于20个）的多肽，很难利用传统的“从头测序”（de novo sequencing）方法进行测序，一方面，由于含有较多氨基酸，得到的串级质谱图往往碎片信息不完整，对谱峰归属造成很大困难，另一方面即使获得了较为完整的串级质谱图，实验室的服务器电脑无法对如此复杂的碎片峰进行合理归纳，往往会造成电脑超负荷运算陷入死循环。本章不仅利用串级质谱图成功鉴定了一种人工合成寡肽（28个氨基酸）的一级结构，并且详细考察了不同类型质谱仪器、不同碎裂方式、不同碎裂能量、不同激光能量、不同分析软件对于测序结果的影响，讨论了含有超过20个氨基酸片断的多肽获得合格串级质谱的条件，也为蛋白质组学研究工作如何制定有效的串级质谱策略提供了有力参考。第六章主要阐述了作为高效液相色谱检测器的四极杆——飞行时间质谱仪（Q-TOF-MS）的研制工作。我们使用三组功能不同的四极杆调制和传输离子，采用正负双脉冲推斥和离子垂直引入的方式将离子束引入到经过优化设计的二级有网式反射器，配合新颖的MCP安装方法和离子检测技术，并使用先进的三级真空系统，最终实现了高灵敏度以及FWHM=11000的高分辨。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 质谱技术的进展

1.1.1 离子源技术的发展

1.1.1.1 电喷雾电离源

1.1.1.2 基质辅助激光解吸电离源

1.1.1.3 大气压化学电离源

1.1.2 质量分析器的发展

1.1.2.1 四极杆质谱

1.1.2.2 离子阱质谱

1.1.2.3 傅立叶变换离子回旋共振质谱

1.1.2.5 新型串联质谱

1.2 蛋白质组学研究技术及生物质谱在蛋白质组学研究中的应用

1.2.1 基于生物质谱的蛋白质组学的新策略、新技术

1.2.2 双向凝胶电泳技术

1.2.3 两维、多维色谱分离技术

1.2.4 蛋白质芯片技术

1.2.5 酵母双杂交技术

1.2.6 串联亲和纯化技术

1.2.7 蛋白质组研究策略

1.3 目前针对低丰度蛋白检测的技术

1.3.1 蛋白质组研究策略面临的挑战

1.3.2 低丰度蛋白定义

1.3.3 低丰度蛋白分离和富集技术

1.3.3.1 亲和色谱分离技术

1.3.3.2 亚细胞器分离

1.3.3.3 蛋白质的顺序提取

1.3.3.4 液相等电聚焦

1.3.3.5 针对MALDI-MS的靶上富集方法

1.3.3.6 固相微萃取方法

1.4 本论文选题目的、意义和创新点

1.5 参考文献

第二章低丰度蛋白靶上一步除盐与富集直接MALDI-MS分析的新方法

2.1 研究背景

2.2 实验部分

2.2.1 材料和试剂

2.2.2 疏水性聚合物的制备

2.2.3 标准蛋白质的溶液酶解方法

2.2.4 质谱仪器与实验条件

2.2.5 微印迹MALDI靶板的制作

2.2.6 双向电泳（2DE）实验条件

2.2.7 胶上酶解方法

2.2.8 商业ZipTipC18微量层析柱的样品处理方法

2.2.9 商业ZipPlate微量层析板的样品处理方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 一步除盐的实施步骤

2.3.2 一步除盐的机理分析与现场观测

2.3.3 肽段富集和除盐能力的研究

2.3.4 不同类型的疏水性聚合物对除盐能力的影响

2.3.5 在人肝蛋白质组表达谱中的应用

2.4 结论

2.5 参考文献:

第三章磷酸化肽段靶上浓缩与除盐直接MALDI-MS分析的研究

3.1 研究背景

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与样品

3.2.2 仪器设备及分析方法

3.2.3 蛋白质溶液酶解

3.2.4 磷酸化肽段的靶上直接浓缩

3.2.5 数据库检索和肽序列分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 磷酸化肽段靶上直接浓缩的过程和机理分析

3.3.2 磷酸化肽段靶上直接浓缩方法的除盐能力

3.3.3 肽段磷酸化位点的串级质谱鉴定

3.3.4 磷酸化肽段靶上直接浓缩与除盐方法的质谱信号重现性的研究

3.4 结论

3.5 参考文献

第四章利用聚合物-无机纳米复合材料快速高效的富集痕量蛋白/肽段的研究

4.1 研究背景

4.2 实验部分

4.2.1 仪器与试剂

4.2.2 聚甲基丙烯酸甲酯接枝纳米碳酸钙材料的表征

4.2.3 质谱仪器和实验条件

4.2.4 标准蛋白质的溶液酶解方法

4.2.5 商业ZipTipC18微量层析柱的样品处理方法

4.2.6 双向电泳（2DE）实验条件

4.2.7 胶上酶解方法

3-PMMA富集蛋白或肽段的实验方法'>4.2.8 采用CaCO₃-PMMA富集蛋白或肽段的实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 实现蛋白/肽段快速高效富集的步骤与机理研究

4.3.2 对多肽吸附行为的研究

4.3.3 对蛋白质吸附行为的研究

4.3.4 富集体系耐盐性的研究

4.3.5 快速富集的验证

4.3.6 质谱信号重现性方面的研究

4.3.7 在实际样品中的应用

4.4 结论

4.5 参考文献

第五章复杂多肽的串级质谱全序列分析研究

5.1 研究背景

5.2 实验部分

5.2.1 仪器试剂

5.2.2 样品预处理

5.2.3 MALDI-TOF-TOF-MS质谱分析方法

5.2.4 ESI-Q-TOF-MS质谱分析方法

5.2.5 分析软件与数据库检索方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 质谱图

5.3.2 CID谱图与PSD谱图的比较:

5.3.3 不同类型质谱结果的比较

5.3.4 不同分析软件的比较

5.4 结论

5.5 参考文献

第六章高效液相色谱检测器—高分辩飞行时间质谱仪的研制

6.1 研究背景

6.2 质谱仪工作原理

6.3 质谱仪硬件构成

6.3.1 真空系统

6.3.2 电喷雾离子源

6.3.3 离子光学系统

6.3.4 飞行时间质量分析器

6.3.5 离子检测系统

6.4 质谱仪软件

6.5 性能与指数指标

6.6 质谱仪特点

6.7 结论

6.8 参考文献

附录1.采用一步除盐法得到鉴定的蛋白质列表

附录2.采用商业ZipPlate微量层析板得到鉴定的蛋白质列表

附录3.纳米碳酸钙表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯材料的表征信息

附录4.用于检测法拉第筒信号的法安级微电流放大器的研制

附录5.部分机械设计图纸

附录6.自制高分辨Q-TOF-MS操作规程与参数调试注意事项

在学期间发表与待发表的学术论文

致谢

生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究

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