论文摘要
本文研究了黄姑鱼的人工雌核发育诱导条件,观察比较了黄姑鱼雌核发育体和正常二倍体的胚胎发育及早期生长情况,利用微卫星和AFLP对雌核发育子代进行了亲子鉴定及相关遗传分析。主要结果如下:1、利用紫外线照射使黄姑鱼精子遗传失活,与卵子授精后再通过冷休克抑制第二极体排放进行倍性恢复,成功诱导出黄姑鱼雌核发育二倍体。精子经强度为3800μw/(cm2·s)的紫外线照射10~100s,受精卵孵化率呈现明显的Hertwig效应;当照射时长达到60s以上,各试验组全部孵出仔鱼均呈现典型的单倍体综合症。精子的紫外线照射时间、受精卵冷休克起始和持续时间三因素三水平正交试验结果表明,精子经紫外线照射60s,受精2min后卵子在3~4℃海水中持续冷休克10min为最佳诱导条件组合,可以获得最高的孵化率(16%)。最佳组合仔鱼形态表现出典型的正常二倍体特征,其细胞相对DNA含量也与正常二倍体相同,经微卫星标记检验证明全部不含有父本基因,为雌核发育二倍体。2、按上述最优条件诱导黄姑鱼雌核发育,观察了雌核发育二倍体(G)、单倍体(H)和正常受精二倍体(N)的胚胎发育过程,并对仔鱼早期生长情况进行了比较。结果显示:(1)受精率N>H>G,孵化率N>G>H,畸形率H>G>N,72h成活率N>G>H;(2)水温(24±0.5)℃,盐度26~27条件下,正常二倍体胚胎经21h10min孵化出膜,雌核发育二倍体和单倍体孵化出膜分别用时23h10min和23h30min;雌核发育二倍体发育滞后主要出现于原肠早期和孵出期,单倍体滞后出现于原肠晚期。从形态上看,单倍体胚胎呈现典型的单倍体综合症,雌核发育二倍体和正常受精二倍体胚胎发育形态正常且两者无明显差异。各组死亡高峰均出现在原肠晚期,单倍体组仔鱼开口前全部死亡;(3)60日龄之前雌核发育二倍体仔鱼生长速度明显慢于正常二倍体且个体间差异较大。3、分别利用微卫星和AFLP分子标记对诱导的黄姑鱼雌核发育子代进行遗传鉴定,并分析了这些分子标记在雌核发育家系和正常对照组家系F1代的传递和分离情况,同时对其纯合性和家系间的遗传关系进行了研究。结果显示:(1)雌核发育家系在8个微卫星位点和5对AFLP引物组合扩增出的位点均未发现父本等位基因,雌核发育诱导率为100%。(2)用于遗传分析的7对微卫星引物在两家系并未发现完全纯合的位点。相对正常对照组家系而言,雌核发育家系平均纯合度提升,个别位点纯合度下降;纯合度最高的位点是LYC0267,纯合度为0.825;纯合度最低的位点是LYC0012,纯合度为0;平均纯合度为0.382,是对照组(0.161)的2.37倍。除位点LYC0012外,其余位点等位基因在雌核发育家系的分离比均符合孟德尔遗传定律(P>0.05)。雌核发育家系个体的纯合位点为0~6个,纯合比例为0.000~0.857。(3)5对AFLP引物共扩增出182条带,21条父本特异性条带,16条母本特异性条带。16条母本特异性条带中有10条出现分离,为杂合位点,其中7个位点在雌核发育家系中显著偏分离(P<0.05);2个母本特异条带在雌核发育家系子代全部出现,而在正常对照组子代部分出现,可能与母本隐性致死基因紧密连锁。(4)根据微卫星和AFLP检测的结果,雌核发育家系与母本的遗传相似性高于正常对照组家系,后者为两性融合个体,同父母本的遗传距离大致相同。