论文摘要
本实验重点是在新建胚胎实验室建立与优化牛卵母细胞及胚胎体外操作技术体系，进一步推动生物胚胎工程的发展，并为牛的体细胞克隆和转基因牛的研究打下基础。为此，从屠宰场收集卵巢，采集卵巢表面直径为2-8mm卵泡的卵母细胞，以TCM199添加20％FBS为基础液，对其进行成熟培养，研究FSH／LH／17β-E2／EGF浓度、卵巢的运输时间和保存温度、卵母细胞采集方法、卵巢所处生理状态等对牛卵母细胞体外成熟的影响；研究了孤雌激活体系与牛卵母细胞在药物中作用时间对牛卵母细胞孤雌激活的影响；研究了受精体系与成熟卵母细胞受精前的处理方法对牛卵母细胞体外受精的影响；还研究了胚胎体外培养体系对牛胚胎体外发育的影响。结果表明：1．在新建胚胎实验室建立了牛卵母细胞的体外成熟体系。在屠宰场选择处于卵泡期的奶牛和黄牛卵巢，保存在30℃生理盐水中4h内运送回实验室，采用抽吸法采卵，采用成熟液Tissue Culture Medium-199（Earle’s）液+20％FBS+50μg/ml LH+50μg／ml FSH+20μg／ml 17β-E2对A、B级卵母细胞进行体外成熟，24小时成熟率可达80％。2．EGF能显著提高牛卵母细胞的成熟率，且随着EGF添加量的不断增加牛卵母细胞的成熟率也呈上升趋势，添加50μg／ml时，成熟率可达到82.2％。但由于药品昂贵，未继续做大剂量添加的比较。3．牛卵母细胞的孤雌激活条件为5mmol／L离子霉素作用5min，2mmol／L 6-DAMP作用4h，36h卵裂率和囊胚率分别可以达到85.1％和26.8％。4．由于IVF-100无需经常配制、保存方便且可以获得较高的卵裂率，所以本实验采用IVF-100为受精液，卵母细胞成熟20小时后采用透酶+口吸管消化的方法处理，获得了较好的受精效果，卵裂率可达（76.8％）。5．采用B2+vero细胞的胚胎共培养体系，可获得较高的卵裂率（80.6％）和囊胚率（32.1％）。