人类心脏发育候选基因TRIM45及BZW2的蛋白相互作用研究及初步功能鉴定

论文摘要

心脏的发育是一个极其复杂并且精细的过程。其主要调控网络由心源性转录因子和生长分化因子构成,这些基因的突变或异常表达会导致早期胚胎死亡或者各种心脏疾病。其中,心肌肥厚是比较常见的一种心脏病。其发病机制一直是心脏疾病机理研究领域的热点。TRIM家族基因在多种细胞功能方面起着重要的作用,包括细胞增殖,分化,发展,发生以及细胞凋亡。本研究室前期克隆了人类TRIM45基因.基因全长3584bp。Northern B lot分析结果显示,TRIM45基因在成人的骨骼肌、脑、胰腺、心脏组织中依次有不同强度的表达。酵母双杂交结果显示TRIM45蛋白能够与SLC25A3蛋白以及DNAJB6蛋白发生相互作用。本文利用免疫共沉淀技术证明了TRIM45蛋白在体内能够与SLC25A3蛋白以及DNAJB6蛋白发生相互作用。DNAJB6蛋白属于热休克蛋白家族（Hsp家族）。已有文献表明,DNAJB6能够通过与NFATc3相互作用来阻断钙调磷酸酶诱导的心肌肥厚,并且DNAJB6能够抑制NFAT-Luc的荧光活性。本研究重复了DNAJB6对NFAT的转录活性调控研究,得到了与文献一致的结果。为了更进一步的了解TRIM45与心肌肥厚的关系,本研究利用荧光报告系统分别研究了TRIM45对心脏标志基因的转录活性调控。所用荧光报告质粒包括NFAT-Luc、SRF-Luc和MEF2C-Luc。结果显示,TRIM45能够强烈抑制ANF-Lu、NFAT-Luc、SRF-Luc和MEF2C-Luc的荧光活性。另外,SLC25A3也能强烈抑制NFAT-Luc的荧光活性。这些结果一起表明TRIM45, SLC25A3, DNAJB6都是心肌肥厚抑制因子,并且可能通过形成复合物来共同抑制心肌肥大。人类BZW2基因是一个新基因,其功能未知。它由bzip结构域和eIF5C结构域构成。BZW2基因在人类,小鼠,大鼠,斑马鱼,猩猩,狗,鸡等物种中均存在同源基因。BZW2基因定位于人类染色体7p21.1,在小鼠中定位于12；12B2。人类BZW2蛋白与小鼠BZW2蛋白同源度非常高,达到了99%。人类BZW2基因全长1883bp,编码419个氨基酸。本文用PCR技术扩增了人类BZW2基因的全长,将目的片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒转入BL21感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔。BZW2多克隆抗体效价为1：50。利用小鼠组织进行Western blot检测分析,结果显示BZW2在小鼠心脏,肌肉以及脑组织中高表达。通过生物信息学分析发现,BZW2蛋白能够与BZW1、PSTPIP1蛋白发生物理相互作用。通过荧光报告系统分析发现,BZW2能够抑制NF-kB和NFAT的转录活性,提示BZW2可能是一个潜在的心脏发育候选基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言和文献综述
• 1.1 心脏发育概述
• 1.2 心肌肥厚的特征
• 1.3 心肌肥厚过程中的重要信号转导途径
• 1.3.1 丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）途径
• 1.3.2 钙信号引起的心肌肥厚的转录机制
• 1.4 心脏发育以及心肌肥厚信号途径中的关键转录因子家族
• 1.4.1 GATA家族
• 1.4.2 NK家族
• 1.4.3 BMP家族
• 1.4.4 MADS框基因家族
• 1.4.5 HAND
• 1.4.6 NFAT家族
• 1.5 TRIM基因家族
• 1.5.1 TRIM家族概述
• 1.5.2 TRIM家族的结构特点
• 1.5.3 TRIM家族的进化
• 1.6 TRIM45基因的前期功能研究
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物信息学软件
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 质粒、细胞和菌株
• 2.1.4 主要实验仪器和耗材
• 2.2 方法
• 2.2.1 心脏组织和细胞总的RNA提取
• 2.2.2 引物设计与合成
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物纯化
• 2.2.5 载体连接
• 2.2.6 感受态细胞制备
• 2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.8 质粒的小量制备
• 2.2.9 阳性克隆筛选和鉴定
• 2.2.10 测序
• 2.2.11 重组质粒的构建
• 2.2.12 真核表达重组质粒的大量制备
• 2.2.13 常规细胞的培养及转染
• 2.2.14 原核细胞诱导蛋白质表达及纯化
• 2.2.15 SDS-PAGE
• 2.2.16 BZW2原核表达的蛋白免疫兔子制备多克隆抗体
• 2.2.17 Western blot免疫印迹检测抗体效价
• 2.2.18 免疫共沉淀（CO-IP）
• 2.2.19 荧光报告系统分析
• 2.2.20 亚细胞定位分析
• 2.2.21 提取蛋白质
• 2.2.22 蛋白质印迹免疫检测（Western-blot）
• 第三章 实验结果及其分析
• 3.1 人类DNAJB6基因的生物信息学分析结果
• 3.2 人类SLC25A3基因的生物信息学分析结果
• 3.3 TRIM45蛋白与DNAJB6蛋白在体内发生相互作用
• 3.4 TRIM45蛋白与SLC25A3蛋白在体内发生相互作用
• 3.5 TRIM45、DNAJB6、SLC25A3基因对心脏标志基因NFAT等的转录活性调控研究
• 3.6 TRIM45基因的拆片抑制NF-KB的转录活性
• 3.7 人类BZW2基因的生物信息学分析结果
• 3.8 BZW2开放阅读框（ORF）的克隆
• 3.9 BZW2的亚细胞定位分析
• 3.10 pGEX-4T-1-BZW2重组质粒的构建
• 3.11 BZW2融合蛋白表达
• 3.12 BZW2兔多克隆抗体制备和效价检测
• 3.13 BZW2蛋白在心脏,肌肉,脑组织中高表达
• 3.14 BZW2的相互作用蛋白预测分析
• 3.15 BZW2抑制NF-KB和NFAT的转录活性
• 第四章 结语
• 第五章 其他工作—LRRC39基因在肌原分化中的作用
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢