利用高蛋白解脂亚罗维亚酵母转化菊粉生产单细胞蛋白的研究

论文摘要

近年来,用于食品和饲料的蛋白质需求量正在不断增加。单细胞蛋白生产技术为解决全球蛋白质短缺的问题提供了一条可行之路。单细胞蛋白的生产作为一个生物转化过程,将低成本的的原材料转变成了拥有高营养价值和市场价值的产品。而选择廉价的原料对于控制单细胞的蛋白生产的成本至关重要。菊粉作为植物的一种贮存性多糖,主要存在于如菊芋、菊苣、大丽花和雪莲果等植物的根茎中。作为一种可再生,廉价和来源丰富的原材料,菊粉资源得到越来越多的重视。这些优势使菊粉和含菊粉的植物成为SCP工业化生产的优质原材料。从酵母Kluyveromyces marxianus CBS 6556中克隆的INU1基因连接到了分泌型表达质粒pINA1317,并且在高蛋白海洋酵母Yarrowia lipolytica SWJ-1b中得到表达。使原本不能分泌菊粉酶的Y.lipolytica SWJ-1b,能够直接利用菊粉生产单细胞蛋白。细胞生长80h后,重组菌株分泌的菊粉酶酶活达到了43.1±0.9 U/ml。采用单次因子方法优化了产单细胞蛋白的最适培养基和最适条件,得到最适培养基组分为（w/v）:菊粉4%,豆饼粉水解液4%,（NH4）2SO4 0.1%,初始pH为6。最佳培养条件为,在28℃和180 rpm振荡培养88h。在以上条件下培养,细胞干重达到19.5g/l,蛋白含量为38.7%（w/w）,总蛋白量为7.54g/l。当该工程酵母菌在含有4.0%的菊粉（w/v）培养基中通过2-l发酵罐发酵72h后,细胞的粗蛋白含量、细胞干重、还原糖含量和总糖的利用率分别达到47.5%（w/w）、20.1 g/l、0.6±0.1 g/l和96.4%（w/w）。当酵母工程菌在含有8%的菊芋（w/v）培养基中通过过2-l发酵罐发酵80h后,细胞的粗蛋白含量、细胞干重、还原糖和总糖的利用率分别达到53.7%（w/w）、20.8 g/l、1.3±0.2 g/l和94.2%（w/w）。所以,Y. lipolytica的重组菌株能够很好的利用菊粉以及含有菊粉的作物生产单细胞蛋白。使用Ni亲和层析法纯化了重组菊粉酶。SDS-PAGE结果表明纯化的重组菊粉酶的分子量约为84 kDa。纯化的重组菊粉酶最适作用温度为50°C,50°C以下具有良好的稳定性;最适作用pH为4.5,在pH 5.0-9.5之间有良好的稳定性; Na+和Zn2+对其酶活有激活作用,Co2+、Ba2+、K+、Hg2+、Cu2+、Ag+和Ni2+对其酶活有抑制作用,其中Ag+和Hg2+表现出较强的抑制作用;蛋白抑制剂SDS对其酶活有较强的抑制作用;对菊粉的Km值为16.7mg/ml,Vmax为0.0052mg/min。重组菊粉酶能够将菊粉分解成单糖和部分寡糖,具有外切酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 菊粉简介
• 2 生产菊粉的作物
• 3 菊粉的利用现状
• 3.1 生产生物燃料
• 3.1.1 生物乙醇
• 3.1.2 生产单细胞油脂
• 3.2 生产高果糖浆
• 3.3 生产低聚菊糖
• 3.4 生产单细胞蛋白
• 3.5 其它化工产品
• 3.5.1 2,3-丁二醇
• 3.5.2 乳酸
• 3.5.3 糖醇
• 4 菊粉酶
• 4.1 菊粉酶简介
• 4.2 产菊粉酶的微生物
• 4.2.1 酵母
• 4.2.2 丝状真菌
• 4.2.3 细菌
• 5 菊粉酶在酵母中的表达
• 6 单细胞蛋白
• 6.1 单细胞蛋白简介
• 6.2 产单细胞蛋白的微生物
• 6.2.1 酵母
• 6.2.2 细菌
• 6.2.3 真菌
• 6.2.4 微藻
• 6.3 单细胞蛋白的营养评价
• 6.4 单细胞蛋白的应用及展望
• 7 本论文的研究内容和意义
• 第二章 菊粉酶基因 INU1 在高蛋白海洋酵母菌 Y lipolytica 中的表达
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 培养基与试剂
• 1.2.1 培养基
• 1.2.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 K marxianus 菊粉酶基因在Y lipolytica 中分泌表达的质粒构建图.
• 1.3.2 PCR 扩增菊粉酶编码基因INU1
• 1.3.3 PCR 产物的回收
• 1.3.4 重组质粒pMD19-INU1 的构建
• 1.3.5 INU1 片段与质粒pINA1317 连接
• 1.3.6 Y lipolytica 尿嘧啶缺陷型突变株22a 的转化
• 1.3.7 转化子基因组插入片段检测
• 1.3.8 转化子酶活性测定及高酶活转化子的筛选
• 1.3.9 转化子培养上清液的SDS-PAGE 和Western blotting 分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 表达质粒pINA1317- INU1 的构建
• 2.2 阳性转化子的鉴定
• 2.3 阳性转化子酶活力测定及高酶活转化子的筛选
• 2.4 转化子培养液上清SDS-PAGE 和Western blotting 的检测结果
• 3 本章小结
• 第三章 高蛋白海洋酵母菌 Y.lipolytica菊粉酶重组菌株利用菊粉及菊芋干粉生产单细胞蛋白的研究
• 0 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基与试剂
• 1.2.1 培养基
• 1.2.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 酵母粗蛋白含量的测定（凯氏定氮法）
• 1.3.2 细胞干重的测定
• 1.3.3 摇瓶发酵生产单细胞蛋白的条件优化
• 1.3.4 菊芋干粉的制备
• 1.3.5 使用2-l 发酵罐发酵生产单细胞蛋白
• 1.3.6 还原糖含量的确定
• 1.3.7 总糖的测定
• 1.3.8 菊粉酶酶活的测定
• 1.3.9 氨基酸组分的测定
• 1.3.10 必需氨基酸指数的计算方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 摇瓶生产单细胞蛋白条件的优化结果
• 2.1.1 不同菊粉浓度对细胞干重、蛋白含量和总蛋白量的影响
• 2.1.2 不同氮源对细胞干重、蛋白含量和总蛋白量的影响
• 2.1.3 最佳氮源浓度的确定
• 2.1.4 温度对细胞干重、蛋白含量和总蛋白量的影响
• 2.1.5 pH 对细胞干重、蛋白含量和总蛋白量的影响
• 2.1.6 细胞干重、蛋白含量和总蛋白量随时间变化曲线
• 2.2 使用2-l 发酵罐发酵单细胞蛋白
• 2.3 转化子细胞氨基酸成分的分析
• 3 本章小结
• 第四章 重组菊粉酶的纯化和酶学性质的研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基和试剂
• 1.2.1 培养基
• 1.2.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 重组菊粉酶的纯化
• 1.3.2 对纯化样品的SDS-PAGE
• 1.3.3 重组菊粉酶的性质
• 1.3.4 菊粉酶水解产物的薄层层析色谱（TLC）
• 2 结果与讨论
• 2.1 重组菊粉酶的SDS-PAGE 结果
• 2.2 重组菊粉酶性质的研究
• 2.2.1 重组菊粉酶的最适反应温度和温度稳定性
• 2.2.2 重组菊粉酶的最适作用pH 和对pH 的稳定性
• 2.2.3 不同金属离子对重组菊粉酶活性的影响
• 2.2.4 蛋白抑制剂对重组菊粉酶活性的影响
• 2.2.5 重组菊粉酶动力学常数的测定
• 2.3 菊粉酶水解产物的薄层层析色谱
• 3 本章小结
• 参考文献
• 附录 英文缩写符号及其中英文名称
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文