猪鸡肠道益生菌株的分离鉴定及其抗TGEV和IBV的作用

论文摘要

本实验从健康的雏鸡和仔猪盲肠中分离鉴定出三株益生菌,采用MTT和细胞病变方法,分别在鸡胚成纤维细胞（CEF）和PK-15细胞模型上初步评价了三株益生菌对TGEV和IBV抑制率的影响,探讨益生菌的抗病毒作用。实验中首先利用革兰氏染色,生化试验,16Sr RNA,抑菌试验等方法分离鉴定出了三株益生菌,分别命名为:L1—德氏乳杆菌德氏亚种（Lactobacillus.delbrueckiisubsp.delbrueckii）、L2—德氏乳杆菌乳亚种（Lactobacillus.delbrueckii subsplactis）和L3—德氏乳杆菌保加利亚亚种（ Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）。利用MTT法测定益生菌处理后的细胞活性,经统计分析得出益生菌对细胞的最大无毒浓度为L1株1011 cfu/ml,L2株1012 cfu/ml,L3株1012 cfu/ml,益生菌培养上清1:2的稀释液,益生菌灭活菌体和破碎菌体成分在实验浓度均未显现细胞毒害现象。根据上述实验结果开展下列益生菌的抗病毒作用研究。实验分组:第1组:益生菌与上述2种细胞预先分别孵育后再攻毒;第2组:2种细胞感染病毒后再接入益生菌;第3组:益生菌与病毒同时接入细胞;第4组:益生菌对照;第5组:病毒对照;第6组:正常细胞对照。实验结果:以MTT法测定益生菌和病毒（TGEV和IBV）处理后的细胞活性,通过公式计算病毒抑制率。结果表明,无论是在PK-15细胞上,还是在CEF细胞上,益生菌成分和不同加入方式均可显著地提高益生菌对TGEV和IBV的抑制率（P﹤0.05）,并且这种作用具有量效关系和时效关系。益生菌-细胞-病毒相互作用后的细胞病变结果显示,益生菌及其培养上清与TGEV和IBV同时接入细胞可以极显著的阻碍TGEV和IBV引发的细胞病变,推测其可能具有直接的杀灭病毒作用。在实验中,我们分别研究了益生菌活菌、培养上清、灭活菌体和破碎菌体成分的抗病毒作用,结果表明,益生菌的各种形式均具有一定的抗病毒作用,但在效果上存在一定的差异,原因可能是其抗病毒作用的机制不同。益生菌与细胞作用后再感染病毒,对TGEV和IBV抑制率升高的结果反映出了益生菌对TGEV和IBV吸附细胞的阻断作用;从益生菌与病毒同时接入细胞后降低病毒对细胞侵害的现象,可以看出益生菌可能对病毒具有直接破坏作用;细胞感染病毒后再接入益生菌对TGEV和IBV抑制率极低的现象说明,病毒感染后益生菌再很难发挥作用。综上所述,在体外益生菌对TGEV和IBV细胞病变影响的实验中,所分离的三株益生菌及其培养上清都极显著地阻碍了TGEV和IBV细胞病变程度,但各菌种之间存在程度不同的差异;这一结果说明益生菌可能具有直接破坏病毒的作用,并且具有菌种特异性。初步确定这三株益生菌具有抗病毒作用。益生菌菌株可以直接破坏TGEV和IBV,又可以阻断病毒对细胞的感染、抑制病毒在细胞内的增殖。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 益生菌的概述
• 1.1.1 益生菌的概念
• 1.1.2 益生菌分类
• 1.1.3 作为益生菌的细菌应具备的条件
• 1.1.4 益生菌的研究状况
• 1.2 TGEV 概述
• 1.2.1 病原
• 1.2.2 致病机制
• 1.3 IBV 概述
• 1.3.1 病原学
• 1.3.2 致病机制
• 1.4 肠道益生菌的分布特点
• 1.5 肠道正常菌群的研究方法
• 1.6 肠道益生菌的治疗作用
• 1.7 肠道益生菌的抗致病微生物作用
• 1.8 目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 毒株
• 2.1.3 细胞及实验动物
• 2.1.4 主要试剂和培养基
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 肠道益生菌的分离与鉴定
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 TGEV 及IBV 在细胞上的增殖
• 2.2.4 TGEV 及IBV 的毒力测定
• 2.2.5 益生菌的细胞毒性试验
• 2.2.6 益生菌抗TGEV 及IBV 作用研究
• 2.2.7 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 益生菌的分离鉴定结果
• 3.1.1 菌落形态观察结果
• 3.1.2 益生菌属的鉴定结果
• 3.1.3 益生菌种的鉴定结果
• 3.1.4 耐酸及耐胆盐实验
• 3.1.5 益生菌的抑菌结果
• 3.1.6 16SrRNA 基因目的片段的 PCR 扩增结果
• 3.1.7 益生菌的生长曲线测定
• 3.1.8 药敏试验结果及不同浓度抗生素的抑制效果
• 3.2 细胞培养结果
• 3.2.1 TGEV 在PK-15 细胞单层上的适应及细胞病变
• 3.2.2 IBV 在CEF 细胞单层上的适应及细胞病变
• 3.3 TGEV 及IBV 的毒力测定
• 3.3.1 TGEV 滴度测定结果
• 3.3.2 IBV 滴度测定结果
• 3.4 益生菌的细胞毒性结果
• 3.5 MTT 法益生菌抗TGEV 及IBV 作用研究
• 3.5.1 益生菌对TGEV 在PK-15 上增殖的影响
• 3.5.2 益生菌对IBV 在CEF 上增殖的影响
• 3.5.3 Reed-Muench 法测定益生菌抗TGEV 及IBV 作用研究
• 4 讨论
• 4.1 肠道益生菌的分离鉴定结果分析
• 4.2 益生菌抗TGEV 和IB 作用效果评价及其可能机制分析
• 4.2.1 益生菌不同接入顺序抗病毒作用分析
• 4.2.2 益生菌不同作用时间的抗病毒作用分析
• 4.2.3 益生菌不同形式抗病毒作用分析
• 4.2.4 细胞病变观察发的结果分析
• 4.2.5 益生菌体外抗病毒作用比较
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文