SARS-CoV X2蛋白亚细胞定位及其诱导细胞凋亡的研究

论文摘要

2002年底,在我国南方发现了一种新型的传染性严重急性呼吸系统综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）,并波及众多国家和地区,引起广泛关注。随后经过各国研究者通力合作,很快确证了一种新的冠状病毒为导致该疾病的病原体,并命名为SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）。紧接着完成了SARS-CoV的基因组测序,并通过多种途径分析了其基因组结构特征。据预测,SARS-CoV的基因组有14个潜在的编码蛋白大于40个氨基酸的开放阅读框架（ORF）,包括复制相关蛋白酶基因和四个主要的结构蛋白（S、M、N、E）基因,以及几个与其它已知蛋白无明显同源性的未知蛋白的编码基因。未知蛋白X2由ORF4编码,共154个氨基酸,与其它已知蛋白没有明显的同源性。本研究把X2基因插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1、pEGFP-C1和载体pCMV-myc,构建重组质粒,转染293、COS-7和VERO细胞,通过细胞荧光和免疫荧光观察发现,X2蛋白定位于细胞核,并且呈点状聚集;进一步与核仁蛋白C23共定位,发现X2蛋白定位于核仁,且在不同细胞中,X2蛋白的定位状态表现一致。通过构建一系列X2蛋白缺失突变体与EGFP融合表达载体,在转染细胞内进行与C23的共定位,发现X2的核仁定位信号位于C端的134-154位氨基酸残基,这与用生物信息学方法分析的结果一致。采用流式细胞仪分析,发现X2蛋白的表达能引起Vero、293和COS-7细胞出现G0/G1期阻滞,并且能够诱导COS-7细胞发生凋亡。这些结果为进一步研究X2蛋白在SARS-CoV的复制、感染和致病方面的作用提供了有用的参考信息。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1.冠状病毒概述
• 1.2.SARS相关冠状病毒研究进展
• 1.2.1 SARS-CoV的病原学研究
• 1.2.2 SARS-CoV基因组结构及其预测编码蛋白
• 1.2.3 SARS-CoV基因组的变异性比较
• 1.2.4 SARS-CoV的系统发生学分析
• 1.2.5 SARS-CoV的来源
• 1.2.6 SARS的病理特征及其引起的机体免疫反应
• 1.2.7 SARS-CoV基因组编码蛋白研究进展
• 1.2.7.1 SARS-CoV S蛋白研究进展
• 1.2.7.2.SARS-CoV E蛋白研究进展
• 1.2.7.3.SARS-CoV的M蛋白研究进展
• 1.2.7.4.SARS-CoV N蛋白研究进展
• 1.2.7.5 SARS-CoV非结构蛋白研究进展
• 1.2.7.6 SARS-CoV未知蛋白研究进展
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与细胞
• 2.1.2 载体与cDNA
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 培养基和缓冲液
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SARS-CoV X2基因的克隆
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 PCR扩增
• 2.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.1.4 PCR产物回收
• 2.2.1.5 酶切消化
• 2.2.1.6 载体连接
• 2.2.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.1.8 热激法转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.1.9 阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.2.2 SARS-CoV X2基因真核表达载体的构建
• 2.2.2.1 pEGFP-N1-X2载体的构建
• 2.2.2.2 pEGFP-C1-X2和pCMV-myc-X2载体的构建
• 2.2.3 X2基因系列缺失突变体的构建
• 2.2.4 重组X2蛋白在转染细胞中的表达
• 2.2.4.1 质粒纯化
• 2.2.4.2 细胞的复苏和培养
• 2.2.4.3 细胞转染
• 2.2.4.4 全细胞蛋白的提取
• 2.2.4.5 Western blotting
• 2.2.5 重组x2蛋白在转染细胞中的定位
• 2.2.6 X2蛋白系列缺失突变体与核仁蛋白C23的共定位
• 2.2.7 PI染色流式细胞仪检测SARS-CoV X2蛋白对293细胞周期的影响
• 2.2.8 SARS-CoV X2蛋白的表达诱导COS-7细胞发生凋亡
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 SARS-CoV X2蛋白的结构分析
• 3.2 SARS-CoV X2基因的克隆及其真核表达载体的构建
• 3.3 X2基因系列缺失突变体的构建
• 3.4 SARS-CoV X2蛋白在转染细胞中的表达
• 3.5 SARS-CoV X2蛋白在转染细胞中的定位
• 3.6 SARS-CoV X2蛋白在转染细胞中不同时间点的定位情况
• 3.7 SARS-CoV X2蛋白与核仁蛋白C23的共定位
• 3.8 X2基因核仁定位信号的检测
• 3.9 X2蛋白的表达引起细胞周期阻滞和凋亡的发生
• 第四部分 讨论
• 4.1 蛋白质的核仁定位
• 4.2 核仁定位蛋白的功能
• 4.2.1 细胞周期调控
• 4.2.2 细胞凋亡
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢