论文摘要
本研究以猪IL-18细胞因子为研究对象,获取了猪IL-18基因全序列,克隆到原核和真核表达载体中,并对其生物学活性进行了一些探讨研究,为今后进一步进行猪IL-18的生物学功能研究及应用提供了依据。根据GenBank中发表的猪IL-18基因核苷酸序列,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出了猪IL-18的全长基因片段,将其克隆到T载体,并进行序列测定与分析。结果表明:猪IL-18基因全长579 bp,编码192个氨基酸,前35个氨基酸残基为信号肽。此序列已被GenBank收录,收录号为DQ 499825。根据获得的猪IL-18核苷酸序列,设计特异性引物,经PCR扩增获得猪IL-18成熟蛋白基因,将其分别非定向插入原核表达载体pGEX-6P-1、pET-28a、pQE30中,获得了重组表达质粒pGEX-IL18、pET-IL18、pQE-IL18。pGEX-IL18、pET-IL18转化大肠杆菌BL21（DE3）,pQE-IL18转化大肠杆菌JM109,在IPTG诱导下重组质粒pGEX-IL18、pET-IL18、pQE-IL18均以融合蛋白形式表达。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白pGEX-IL18约为45 kDa,与预期的蛋白大小相符,其最大表达量占细菌总蛋白的28%;融合蛋白pET-IL18约为22 kDa,与预期的蛋白大小相符,其最大表达量占细菌总蛋白的27%;融合蛋白pQE-IL18约为19 kDa,与预期的蛋白大小相符,其最大表达量占细菌总蛋白的17%。选取表达量较高的pGEX-IL18表达产物经分离、纯化、复性后,进行T淋巴细胞转化试验（MTT法）。检测表明,IL-18具有明显促进猪T淋巴细胞转化的生物学功能。用细胞病变抑制法测定表达蛋白活性,结果表明猪IL-18在PK15细胞上抗PRV、PPV的活性分别为2.00×103U/mg、2.24×103U/mg,在Marc145细胞上抗PRRSV的活性为2.50×103U/mg。再将猪IL-18基因非定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,成功构建重组表达质粒pcDNA-IL18。将其转染PK15细胞后,RT-PCR检测结果表明,猪IL-18基因已经整合到PK15细胞染色体上。将重组质粒pcDNA-IL18、载体质粒pcDNA3.1、猪伪狂犬活疫苗、重组质粒pcDNA-IL18联合猪伪狂犬活疫苗分别肌注免疫小白鼠,共免疫两次,同时设非免疫对照组。免疫后8周,应用MTT法检测各免疫组小白鼠脾脏淋巴细胞转化效果。结果表明:重组质粒pcDNA-IL18组、重组质粒pcDNA-IL18联合猪伪狂犬活疫苗组与猪伪狂犬活疫苗组显著高于载体对照组。综合本研究,成功获得了猪IL-18基因的全序列:成功构建了猪IL-18三种原核重组表达质粒,得到相应的重组蛋白;成功构建了真核重组表达质粒pcDNA-IL18。表明猪IL-18基因具有一定的抗病毒活性,能够提高机体的细胞免疫水平,为进一步研制安全、有效的猪IL-18分子佐剂提供了一定的依据。