水稻OsTUA2基因克隆与功能研究

论文摘要

侧根是植物水分和养分吸收的重要器官,侧根的发生发育一直是植物器官发育研究的重要方向。从水稻（Kasalath,indica）EMS诱变突变体库中我们筛选到了3个短侧根,侧根数减少突变体。通过亚甲基兰对3天苗龄野生型（WT）和突变体的侧根原基染色,与它们7天形成的侧根数相比,发现突变体侧根的减少一方面是由于侧根原基起始的减少,另一方面是因为一部分已经形成的侧根原基不能突破表皮发育成侧根。经图位克隆及转基因回复证明三个突变体都是由位于第11条染色体上的一个编码α微管蛋白基因OsTUA2（LOCOs11g0247300,物理位置7879771bp）的不同突变引起的,该三个等位突变体记为Ostua2-1,Ostua2-2,Ostua2-3。其中Ostua2-1突变体由点突变造成,在ORF309bp由T突变成A;Ostua2-2由ORF563-565bp的TCC突变成GAGAG;Ostua2-3缺失ORF292-314bp的23bp的一个片段。因为突变方式的不同,第一个等位突变体与后面两个在表型上存在某些差异。RT-PCR分析表明OsTUA2是组成型表达基因,在根、茎、叶和穗中都表达。OsTUA2亚细胞定位在整个细胞中。微管蛋白基因在生物体中是非常保守的,OsTUA2基因的突变使突变体在整个生长期的发育都受到影响,植株较矮,抽穗期延长,穗变短。OsTUA2的突变,除了侧根原基发育受阻,侧根数减少外,主根和不定根的生长也不同程度受阻。Ostua2-2,Ostua2-3两个等位突变体的主根受到严重抑制。在低磷条件下,它们两个的根伸长被强烈诱导,35天后根长与WT的差异由正常磷的60%减少到15%。说明它们对低磷更敏感。在盐胁迫条件下生长10天的苗与对照相比,WT的地上和地下部分生长稍微有点抑制,但突变体的地上部严重受阻。突变体的叶子萎蔫,第一张叶子小而枯黄。Ostua2-1的第二张叶子蜷在里面,不能伸展出来;Ostua2-2/-3的第二张叶子卷曲,叶子上部枯黄。Ostua2-1的根稍微变短,但Ostua2-2/-3的根长严重受阻。说明突变体对盐胁迫比WT更敏感。在微管特异性的药物微管抑制剂Propyzamade的处理下,Ostua2-2和Ostua2-3的主根伸长严重受阻,而且根尖膨胀,根毛被强烈诱导,显示它们对微管抑制剂的反应比WT更敏感。

论文目录

• 致谢
• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一部分 植物侧根的发生发育过程研究进展
• 引言
• 1.侧根的发生发育
• 1.1 侧根的起始过程的调节
• 1.1.1 侧根的起始需要auxin和调节蛋白的降解
• 1.1.2 侧根起始过程中的细胞周期调控与auxin信号的关系
• 1.1.3 影响侧根起始发育的其他激素
• 1.1.4 与激素信号不相关的调节侧根起始路径
• 1.2 侧根原基起始后的调节过程
• 1.2.1 植物激素对侧根原基的发育和分生组织的激活过程的调节
• 1.2.2 影响侧根伸长的植物激素
• 1.2.3 参与调控侧根原基发育过程的基因
• 1.3 营养元素和环境因子对侧根发育的影响和调控
• 1.3.1 局部供氮和系统供氮对根结构的影响
• 1.3.2 磷对根的构型的调节
• 第二部分 微管的结构和功能
• 1 微管的结构
• 1.1 与细菌FtsZ的同源性
• 1.2 微管蛋白的侧面连接
• 1.3 微管的动态和极性
• 1.4 微管的核化
• 1.5 微管结合蛋白MAPs的稳定作用
• 1.6 微管的解聚
• 1.7 联系微管和细胞膜的结构
• 2 微管的功能
• 2.1.维持细胞及器官形态
• 2.2 参与染色体的运动,调节细胞分裂
• 2.3 微管蛋白在植物适应低温胁迫中的功能
• 2.4 微管在盐胁迫中的作用
• 2.5 微管与纤维素合成之间的关系
• 2.6 参与细胞内信号转导
• 2+对微管骨架的调节'>2.6.1 Ca²⁺对微管骨架的调节
• 2+和CaM共同调节微管骨架的装配'>2.6.2 Ca²⁺和CaM共同调节微管骨架的装配
• 2+通道的调控'>2.6.3 微管骨架对Ca²⁺通道的调控
• 2.6.4 PLD与微管之间的信号转导
• 第二章 突变体Ostua2的筛选、表型鉴定和基因克隆
• 1 水稻根毛突变体筛选
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 突变体筛选
• 1.2.2 水稻营养液配方
• 1.2.3 水稻生长条件
• 2
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 表型观测
• 2.2.2 植株生长与根系参数测定
• 2.2.3 侧根原基形成的观察
• 2.2.4 盆栽及农艺学性状分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 突变体的表型及根部参数
• 2.3.2 侧根原基形成的观察
• 2.3.3 盆栽条件下突变体农艺性状的分析
• 3 突变体的遗传分析及基因克隆
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 2群体的构建'>3.2.1 突变体的F₂群体的构建
• 3.2.2 突变体的遗传分析
• 3.3 结果与分析
• 4 突变基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 2突变体样品DNA的提取'>4.2.1 F₂突变体样品DNA的提取
• 4.2.2 图位克隆
• 4.2.2.1 多态标记的选择
• 4.2.2.2 PCR扩增
• 4.2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2.3 候选基因的确定
• 4.2.3.1 cDNA第一链的制备
• 4.2.3.2 目的基因PCR扩增
• 4.2.3.3 连接T载体
• 4.2.3.4 热激转化DH5α
• 4.2.4.5 测序和序列比对
• 4.3 结果与分析
• 5 突变体中OsTUA2基因的功能互补验证
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 回复载体的构建
• 5.2.2 农杆菌介导的水稻（籼稻）转化
• 5.2.2.1 水稻成熟胚愈伤组织的准备
• 5.2.2.2 电转化农杆菌感受态细胞的制备
• 5.2.2.3 电击法转化农杆菌
• 5.2.2.4 农杆菌的培养
• 5.2.2.5 共培养及抗性愈伤的筛选
• 5.2.2.6 抗性愈伤的分化及成苗
• 5.2.2.7 转基因苗的锻炼和移栽
• 5.2.3 RT-PCR分析
• 5.3 结果与分析
• 6 小结与讨论
• 第三章 水稻OsTUA2基因生物信息学及表达分析
• 1 OsTUA2和水稻α微管蛋白家族的分析
• 1.1 方法
• 1.2 结果与分析
• 2 基因表达分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 3 OsTUA2蛋白的亚细胞定位分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 sGFP融合载体的构建
• 3.2.2 样品的预处理
• 3.2.3 微弹的制备
• 3.2.4 质粒的包裹
• 3.2.5 PDS-1000/He型基因枪的操作步骤
• 3.2.6 轰击后样品的处理
• 3.2.7 GFP荧光的观察
• 3.3 结果与分析
• 4 小结与讨论
• 第四章 磷胁迫、盐胁迫和药物条件对Ostua2突变体的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 磷胁迫处理
• 2.2 盐胁迫处理
• 2.3 微管抑制剂药物处理
• 3 结果与分析
• 3.1 磷胁迫对突变体的影响
• 3.2 盐胁迫对突变体的影响
• 3.3 微管抑制剂对突变体的影响
• 4 小结与讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献