羊附红细胞体PCR诊断方法的建立和猪附红细胞体病的治疗试验

羊附红细胞体PCR诊断方法的建立和猪附红细胞体病的治疗试验

论文摘要

附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议,传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体,但是近年来根据16S rRNA基因的系统发育分析的结果表明,附红细胞体更接近于支原体(Mycoplasma)。直接镜检是目前临床上诊断该病的主要手段,包括鲜血压片和涂片染色,但该方法假阳性较多见。动物实验也是确诊的手段之一,但所费时间太久。血清学诊断方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等,但由于附红细胞体抗体水平的变化没有规律而常出现假阴性的结果。鉴于上述原因,为了建立特异准确的诊断方法,本研究首先进行了羊附红细胞体病的PCR诊断方法的研究。为建立特异、敏感、快速的羊附红细胞体诊断方法,利用原核生物16S rRNA基因通用引物扩增羊附红细胞体16S rRNA基因序列,并进行序列比对和系统发育树分析。根据所测得的羊附红细胞体16S rRNA基因序列,设计一对种特异性引物,建立了羊附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验表明,此诊断方法只能特异性地扩增羊附红细胞体的16S rRNA基因序列的特异性片段,检测羊附红细胞体最低DNA量为4.5fg。利用该方法对湖北省羊附红细胞体感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率为17.48%,说明羊附红细胞体在湖北省的流行情况比较广泛。为了验证新药二丙酸咪唑苯脲对猪附红细胞体病的治疗效果,本试验以PCR检测阳性的断奶仔猪为对象,注射免疫抑制剂诱导发病后进行治疗,试验设二丙酸咪唑苯脲高中低剂量组,血虫净治疗组,阳性对照组和阴性对照组,结果证明二丙酸咪唑苯脲在2.0mg/kg剂量时,对附红细胞体有一定的抑制和杀灭作用,效果最好,优于血虫净。本实验的结果为临床应用二丙酸咪唑苯脲治疗猪附红细胞体病提供了重要依据。近几年来,国内有关猪病的报道似乎以猪附红细胞体病为多,凡遇到高烧、黄疸、皮肤发红等情况往往都以附红细胞体病定论。在调查和防治工作中血液涂片镜检发现了一种异常现象,血液中存在一种新的疑似病原,有人暂命名为“猪血鞭毛虫病”。该疑似病原体存在于病猪血液中,有多种形态,其中典型的呈纺锤形、两极长有鞭毛。病猪的临床症状类似于猪附红细胞体病。随着病情的发展,常在发生区域流行蔓延,病猪对早期用过的一些治疗药物耐受或产生抗药性,严重影响了一些农村地区养猪业的发展。为此,本试验对该病的病原学、临床表现等进行了研究,并探讨了该病的治疗方法,为揭示这一现象提供科学依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 附红细胞体的起源
  • 1.2 病原学研究
  • 1.3 流行病学研究
  • 1.4 致病性
  • 1.5 临床症状
  • 1.6 分子生物学研究
  • 1.7 诊断技术研究
  • 1.7.1 显微镜检
  • 1.7.2 血清学诊断
  • 1.7.3 分子生物学诊断
  • 1.7.4 试验动物的接种
  • 1.8 预防和治疗
  • 第二章 羊附红细胞体PCR检测方法的建立
  • 2.1 研究目的和意义
  • 2.2 材料和方法
  • 2.2.1 病原采集
  • 2.2.2 质粒和菌株
  • 2.2.3 试剂和仪器
  • 2.2.4 主要试剂与溶液的配制
  • 2.2.5 羊附红细胞体16S rRNA gene序列的克隆和进化分析
  • 2.2.5.1 模板的提取
  • 2.2.5.2 引物设计
  • 2.2 5.3 扩增体系及反应条件
  • 2.2 5.4 PCR产物的回收与纯化
  • 2.2.5.5 PCR产物的克隆、鉴定及序列测定
  • 2.2.5.6 序列同源性的比较和系统进化分析
  • 2.2.6 显微镜检测方法
  • 2.2.6.1 鲜血压片观察
  • 2.2.6.2 姬姆萨染色
  • 2.2.6.3 吖啶橙染色
  • 2.2.7 PCR检测方法的建立
  • 2.2.7.1 特异性引物的设计
  • 2.2.7.2 特异性引物扩增体系及反应条件
  • 2.2 7.3 PCR反应条件的优化
  • 2.2.7.4 PCR的特异性试验
  • 2.2.7.5 PCR的敏感性试验
  • 2.2.8 PCR诊断方法的临床应用
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 通用引物PCR扩增结果
  • 2.3.2 羊附红细胞体16S rRNA基因质粒的构建和鉴定
  • 2.3.3 通用引物PCR产物测序结果
  • 2.3.4 系统进化树的建立和分析结果
  • 2.3.5 羊附红细胞体的显微检查
  • 2.3.5.1 鲜血压片红细胞形态的观察
  • 2.3.5.2 姬姆萨染色结果的观察
  • 2.3.5.3 吖啶橙染色结果的观察
  • 2.3.6 PCR检测方法的建立
  • 2.3.6.1 特异性引物PCR扩增结果
  • 2.3.6.2 双酶切鉴定结果
  • 2.3.6.3 特异引物PCR产物测序结果
  • 2.3.6.4 最佳复性温度的确定
  • 2+浓度的筛选结果'>2.3.6.5 最佳Mg2+浓度的筛选结果
  • 2.3.6.6 特异性试验结果
  • 2.3.6.7 敏感性试验
  • 2.3.7 临床样品的检测结果
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 通用引物扩增以及质粒的鉴定
  • 2.4.2 附红细胞体的种类及分类
  • 2.4.3 显微镜检查方法
  • 2.4.4 羊附红细胞体PCR的敏感性
  • 2.4.5 PCR检测方法的临床应用
  • 第三章 二丙酸咪唑苯脲对猪附红细胞体病的疗效研究
  • 3.1 研究目的和意义
  • 3.2 材料和方法
  • 3.2.1 试剂和仪器
  • 3.2.2 实验动物
  • 3.2.2.1 实验动物的选择
  • 3.2.2.2 实验动物的分组和饲养管理
  • 3.2.3 试验方案
  • 3.2.3.1 附红细胞体病的诱发
  • 3.2.3.2 治疗方案
  • 3.2.4 指标检测
  • 3.2.4.1 附红细胞体消长情况
  • 3.2.4.2 临床症状的观察
  • 3.2.4.3 相对增重率
  • 3.2.4.4 血液生理生化指标
  • 3.2.5 数据处理
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 附红细胞体病的诱发结果
  • 3.3.2 药物治疗结果
  • 3.3.2.1 临床症状的变化
  • 3.3.2.2 附红细胞体的消长情况
  • 3.3.2.3 PCR检测结果
  • 3.3.2.4 增重结果
  • 3.3.3 生理生化指标的变化
  • 3.3.3.1 各组血糖(GLU)浓度变化
  • 3.3.3.2 各组谷草转氨酶(AST/GOT)和谷丙转氨酶(ALT/GPT)变化
  • 3.3.3.3 各组总胆红素(TBI)变化
  • 3.3.3.4 各组尿素氮(BUN)变化
  • 3.3.3.5 各组红细胞压积(MCV)和血红蛋白浓度(HGB)变化
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 猪附红细胞体急性感染的诱导
  • 3.4.2 二丙酸咪唑苯脲的治疗效果
  • 3.4.3 生理生化指标的变化
  • 3.4.4 预防和管理
  • 第四章 猪疑似鞭毛虫病的探索
  • 4.1 研究目的和意义
  • 4.2 材料和方法
  • 4.2.1 仪器
  • 4.2.2 主要试剂与溶液的配制
  • 4.2.3 实验动物
  • 4.2.2.1 实验动物的挑选
  • 4.2.2.2 实验动物的分组
  • 4.2.4 显微镜观察方法
  • 4.2.4.1 姬姆萨染色
  • 4.2.5.2 吖啶橙染色
  • 4.2.5 试验方案
  • 4.2.5.1 病原学试验方案
  • 4.2.5.2 药物治疗试验方案
  • 4.2.5.3 电镜观察
  • 4.2.6 数据处理
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 姬姆萨染色显微镜检查
  • 4.3.2 透射电子显微镜观察结果
  • 4.3.3 病原学试验结果
  • 4.3.4 药物治疗试验结果
  • 4.3.5 阳性猪剖检病变
  • 4.4 讨论
  • 参考文献
  • 附录1 缩略词表
  • 致谢
  • 相关论文文献

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