大鼠蛛网膜下腔出血后脑微血管的比较蛋白质组分析

论文摘要

目的建立激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）技术分离脑微血管和微血管蛋白质组双向凝胶电泳（two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE）的技术平台，运用比较蛋白质组学分析鉴定蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）后不同时间点脑微血管的差异表达蛋白质，为在蛋白质水平进一步阐明SAH后微血管损伤的分子机制奠定基础。方法1建立SAH模型：采用视交叉前池注血法建立大鼠SAH模型。2分析SAH后脑微血管的动态改变：应用荧光分光光度计和荧光显微镜方法分别检测SAH后不同时间点血脑屏障（blood–brain barrier,BBB）通透性的动态改变，同时利用透射电镜观察其超微结构变化，并确定微血管改变的时相。3LCM分离SAH后皮质微血管：采用免疫组织化学染色（CD31单克隆抗体）标记微血管内皮细胞，使用LCM分离皮质微血管。4运用比较蛋白质组学分析SAH后不同时间点脑微血管的差异表达蛋白谱：通过优化2-DE的各种条件和参数，确定最佳的样品上样量、等电聚焦（isoclectfic focusing, IEF）、染色方法等。在此基础上，对SAH后不同时间点脑微血管蛋白质组进行2-DE分离。使用PDQuest软件对2-DE图像进行分析，筛选出不同时间点脑微血管的差异表达蛋白点。候选差异表达蛋白斑点经胶内酶解、基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析，得到肽指纹图谱（peptide mass fingerprint,PMF），使用Mascot软件在Swiss-Prot或NCBInr数据库中检索鉴定差异表达蛋白质，并对差异蛋白质进行生物信息学分析。5验证候选差异表达蛋白：使用Western blotting验证感兴趣的蛋白质。结果1．SAH后6h时，可见血液广泛分布在前颅窝底、Willis环、基底池周围以及大脑半球和小脑。2．SAH引起大脑皮质BBB通透性增加。BBB通透性开始增加出现在SAH后24h，于36h达最高峰，然后在48h开始逐渐减少，至72h恢复正常。透射电镜观察，在SAH后36h，毛细血管周围水肿明显，管腔受压；星形胶质细胞足突肿胀，线粒体轻度肿胀，但其细胞膜尚保存；内皮细胞管腔面不光滑，表面微绒毛增多，但紧密连接未见开放；基膜连续且完整。3．优化PEN切片的固定、染色、脱水等制备方法和LCM切割参数。应用LCM技术分离SAH6h组、SAH36h组皮质微血管，分别得到32000、32500条微血管。4．通过优化2-DE条件，最终确定合适的样品上样量为120μg、非线性pH3-l0IPG胶条、最佳染色方法为银染。通过对SAH后6h、36h脑微血管蛋白质组的2-DE图像进行对比分析，发现有81个蛋白质斑点表达有差异，其中有48个蛋白点表达明显上调，有33个蛋白点表达明显下调。对其中30个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS和生物信息学分析后，鉴定出了24种可能的差异表达蛋白。5．Western blotting法对VDAC1、MAPK10两个感兴趣的蛋白质进行了鉴定，结果与2-DE分析的结果一致：与SAH6h组相比，SAH36h组脑微血管中VDAC1、MAPK10蛋白含量均明显增加。结论1视交叉前池注血模型更好地模拟临床SAH，重复性好，适合于前循环动脉瘤性SAH后病理生理学机制的研究。2SAH引起BBB结构和功能最显著的变化出现在36h，而且，这些病理改变对SAH后继发性脑损伤和不良预后有着重要的影响。3LCM技术是一种强有力的分离方法，能从脑组织中分离出纯度较高的微血管，可用于基因组学和蛋白质组学研究。4鉴定出的24种差异表达蛋白可能在SAH后脑微血管损伤过程中起重要作用。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 大鼠 SAH 后脑微血管改变的动态研究
• 第一节 大鼠蛛网膜下腔出血模型的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 死亡率
• 2.2 大体标本观察
• 3 讨论
• 第二节 大鼠 SAH 后 BBB 破坏的动态研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 脑水含量的变化
• 2.2 BBB 通透性的动态变化
• 2.3 荧光显微镜观察
• 2.4 BBB 超微结构变化
• 3 讨论
• 3.1 实验方法
• 3.2 BBB 功能障碍的机制
• 3.3 BBB 功能障碍的临床意义
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 LCM 分离脑微血管及蛋白质组 2-DE 的优化
• 第一节 LCM 分离大鼠脑微血管
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 脑微血管蛋白质组 2-DE 的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 3.1 样品制备
• 3.2 IEF
• 3.3 SDS-PAGE
• 3.4 染色方法
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 大鼠 SAH 后脑微血管的比较蛋白质组分析
• 第一节 大鼠 SAH 后脑微血管差异表达蛋白的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 SAH 6h 组和 SAH 36h 组脑微血管蛋白质浓度
• 2.2 SAH 6h 组和 SAH 36h 组脑微血管蛋白质 2-DE 图谱
• 2.3 SAH 后脑微血管蛋白质组的差异表达分析
• 2.4 差异表达蛋白的质谱鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 脑微循环改变对 SAH 预后的影响
• 3.2 SAH 后脑微血管的差异表达蛋白
• 第二节 候选差异表达蛋白的验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 3.1 电压依赖性阴离子通道蛋白 1（VDAC1）
• 3.2 丝裂原活化蛋白激酶 10（MAPK10）
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文、参加学术会议