小冠花抗L-羟基脯氨酸（Hyp）变异系离体筛选及其耐盐性研究

论文摘要

本研究以小冠花（Coronilla varia L.）子叶来源的愈伤组织为材料,经叠氮化钠（NaN3）诱变处理后,以脯氨酸类似物L-羟基脯氨酸（Hyp）为筛选剂,通过直接筛选培养,获得了3个过量累积游离脯氨酸的Hyp抗性细胞系（Xr1,Xr2和Xr3）。经体细胞胚胎发生途径,高频率再生大量植株。抗性生长试验证明,抗性系愈伤组织、再生植株及其有性、无性后代耐盐（NaCl）性明显增强。生理生化特性分析表明,抗性系较对照系游离氨基酸特别是游离脯氨酸含量显著增加,脯氨酸合成关键酶P5CS活性增强,降解酶PDH活性降低:Na+累积少,K+选择性吸收能力强,细胞内K+/Na+比例高;抗氧化系统SOD和POD酶活性高,细胞膜相对透性小,膜脂过氧化产物（丙二醛）含量低。SDS-PAGE凝胶电泳显示变异系出现新蛋白组分,分子量为24KD。RAPD多态分析表明,抗性系基因组DNA分子水平发生了变化。其主要结果如下: 1.建立了小冠花高效体细胞胚胎发生和植株再生体系。10 d龄无菌苗子叶在附加2.0 mg/L 2,4-D,0.5 mg/L KT的MS培养基上100%诱导出松软愈伤组织,并于含有1.0 mg/L 2,4-D,1.0 mg/LNAA,0.5 mg/L KT和300 mg/L脯氨酸的MSB培养基上培养35天后,形成大量体细胞胚,其数量高达625个/克。在附加1.0mg/L KT、0.1 mg/L IBA和300 mg/L脯氨酸的培养基上体胚发育成植株的平均数约为21棵/克。 2.采用固定诱变剂浓度,变换处理时间的方法,确定了诱变处理愈伤组织适宜的半致死剂量为0.5%NaN3（pH5.4）处理1小时45分钟。 3.用直接筛选法,从诱变处理的550块愈伤组织中,最终筛选出3个抗50mmol/L（全致死剂量）L-羟基脯氨酸（Hyp）的变异体,选择效率为0.545%。经无胁迫条件扩增后,在附加1.0 mg/L2,4-D,1.0 mg/LNAA,0.5 mg/LKT和300mg/L脯氨酸的MSB培养基上形成大量体细胞胚并再生植株。 4.抗性生长试验表明,抗性系具有较高的耐盐（NaCl）性,并且耐盐性能够在再生植株有性、无性后代中传递。以愈伤组织相对生长率为指标,Xr1、

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要缩略语
• 文献综述
• 1 植物体细胞无性系变异与抗性突变体的离体筛选
• 1.1 植物体细胞无性系变异的普遍性
• 1.2 体细胞无性系变异的遗传学基础
• 1.2.1 体细胞无性系染色体结构与数目的变异
• 1.2.2 体细胞无性系DNA及基因水平的变异
• 1.3 体细胞无性系变异在植物抗性突变体离体筛选中的应用
• 1.3.1 氨基酸与氨基酸类似物抗性突变体的离体筛选
• 1.3.2 植物耐旱、耐寒突变体的离体筛选
• 1.3.3 植物耐盐突变体的离体筛选
• 2 植物渗透调节与耐盐性
• 2.1 无机离子与植物渗透调节
• 2.1.1 无机离子离子的选择性吸收
• 2.1.2 盐离子的区隔化
• 2.2 甜菜碱与植物的渗透调节
• 2.3 脯氨酸与植物的渗透调节
• 2.3.1 脯氨酸累积及其累积机理
• 2.3.2 脯氨酸累积与植物的渗透调节
• 3 植物Hyp抗性（耐盐）细胞突变体离体筛选研究现状与意义
• 3.1 植物Hyp抗性（耐盐）细胞突变体离体筛选现状
• 3.2 植物Hyp抗性（耐盐）细胞突变体的鉴定
• 3.3 离体筛选植物Hyp抗性（耐盐）突变体存在问题及展望
• 4 本研究的出发点-目的与意义
• 材料与方法
• 1 小冠花抗羟脯氨酸[L-Hydroxyproline（Hyp）]变异细胞系的筛选
• 1.1 供试材料
• 1.2 愈伤组织的诱导和保存
• 1.3 胚性愈伤组织的诱导和植株再生
• 1.3.1 胚性愈伤组织的诱导
• 1.3.2 体细胞胚胎的发生和植株再生
• 1.3.3 再生植株的炼苗与移栽
• 1.3.4 体细胞胚胎发生发育的统计观察
• 3）诱变剂量的确定和诱变处理'>1.4 叠氮化钠（NaN₃）诱变剂量的确定和诱变处理
• 1.5 正常愈伤组织对筛选剂Hyp的敏感性试验
• 1.6 抗Hyp变异细胞的分离筛选
• 2 Hyp抗性细胞系对Hyp、NaCl和PEG胁迫的抗性生长试验
• 3 Hyp抗性细胞系愈伤组织的生理生化特性分析
• 3.1 游离脯氨酸含量测定
• 1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鸟氨酸转氨酶（OAT）和脯氨酸脱氢酶（PDH）活性测定'>3.2 △¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鸟氨酸转氨酶（OAT）和脯氨酸脱氢酶（PDH）活性测定
• 3.3 游离氨基酸组分分析
• 3.4 可溶性糖含量测定
• 3.5 盐胁迫蛋白的SDS-PAGE电泳及其含量测定
• +、k⁺含量测定'>3.6 Na⁺、k⁺含量测定
• 3.7 细胞膜渗透性的测定
• 3.8 丙二醛含量的测定
• 3.9 过氧化物酶（POD）活性测定
• 3.10 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 4 Hyp抗性细胞系及其对照系总DNA的RAPD分析
• 4.1 抗性细胞系及其对照系愈伤组织总DNA的提取
• 4.2 DNA提取液的检测
• 4.3 Hyp抗性细胞系及其对照系基因组DNA的RAPD多态性检测
• 5 Hyp抗性细胞系胚性愈伤组织的诱导和植株再生
• 6 Hyp抗性细胞系再生植株当代及其后代对Hyp和NaCl耐性试验
• 6.1 Hyp抗性细胞系再生植株当代对Hyp和NaCl的耐性试验
• 6.2 Hyp抗性细胞系再生植株无性繁殖后代营养生长期对Hyp和NaCl的耐受性试验
• 6.3 Hyp抗性细胞系有性繁殖一代种子萌发期对Hyp和NaCl的耐受性试验
• 6.4 抗性细胞系有性繁殖一代种子萌发子叶诱导的次级愈伤组织对Hyp和NaCl的耐受性试验
• 7 Hyp抗性细胞系再生植株及其后代生理生化特性测定
• 7.1 Hyp抗性细胞系再生植株及其有性、无性繁殖后代游离脯氨酸含量的测定
• 7.2 Hyp抗性细胞系再生植株及其有性、无性繁殖后代P5CS酶活性的测定
• 实验结果
• 1 小冠花高频率体细胞胚胎发生及其植株再生体系的建立
• 1.1 不同外植体诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生的效果
• 1.2 基本培养基对小冠花子叶体细胞胚胎发生和植株再生的影响
• 1.3 外源激素对小冠花子叶体细胞胚胎形成与植株分化的影响
• 3诱变剂量的确定'>2 NaN₃诱变剂量的确定
• 3 筛选剂L-羟脯氨酸（Hyp）对小冠花正常愈伤组织生长的影响及全致死剂量的确定
• 4 Hyp抗性细胞系的分离筛选
• 5 Hyp抗性细胞系对Hyp、NaCl和PEG（6000）的耐受性
• 5.1 抗性细胞系对Hyp的耐受性
• 5.2 抗性细胞系对NaCl的耐受性
• 5.3 抗性细胞系对聚乙二醇（PEG）的耐受性
• 6 Hyp抗性细胞系的生理生化特性
• 6.1 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系几种主要渗透调节物质含量的变化及其与耐盐性的相关性
• 6.1.1 NaCl胁迫条件下Hyp抗性系游离脯氨酸的累积及其与耐盐性的相关性
• 6.1.2 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系游离氨基酸含量的变化及其与耐盐性的相关性
• 6.1.3 NaCl胁迫条件下Hyp抗性系可溶性糖含量变化及其与耐盐性的相关性
• +、k⁺含量变化及其与耐盐性的相关性'>6.1.4 NaCl胁迫条件下Hyp抗性系Na⁺、k⁺含量变化及其与耐盐性的相关性
• 6.2 NaCl与PEG（水分）胁迫条件下Hyp抗性细胞系细胞膜相对透性及丙二醛含量的变化
• 6.2.1 NaCl与PEG胁迫条件下Hyp抗性细胞系细胞膜相对透性的变化
• 6.2.2 NaCl与PEG胁迫下Hyp抗性细胞系丙二醛含量的变化
• 6.3 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系抗氧化系统酶活性的变化
• 6.3.1 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系SOD酶活性的变化
• 6.3.2 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系POD酶活性的变化
• 6.3.3 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系SOD、POD酶活性与游离脯氮酸含量的相关性
• 6.4 Hyp抗性细胞系脯氨酸代谢特征及其与耐盐性的相关性
• 6.4.1 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系愈伤组织中脯氨酸代谢途径关键酶（P5CS、OAT和 PDH）活性的变化
• 6.4.2 Hyp抗性细胞系愈伤组织中谷氨酸、精氨酸含量变化及其与脯氨酸累积的相关性
• 6.4.3 外源脯氨酸、谷氨酸和精氨酸对Hyp抗性细胞系游离脯氨酸含量的影响
• 6.4.4 外源脯氨酸和NaCl对Hyp抗性细胞系脯氨酸合成关键酶（P5CS、OAT）活性的影响
• 7 Hyp抗性细胞系耐盐性的分子生物学特性
• 7.1 NaCl胁迫条件下Hyp抗性细胞系蛋白质含量及组分的变化
• 7.2 Hyp抗性细胞系基因组DNA的RAPD分析
• 7.2.1 基因组DNA的提取与检测
• 7.2.2 所用引物及扩增结果
• 7.2.3 Hyp抗性系与对照系RAPD多态性及其遗传背景分析
• 8 Hyp抗性细胞系胚性愈伤组织的诱导、体细胞胚胎发生及其植株再生
• 9 Hyp抗性细胞系再生植株及其有性、无性繁殖后代对Hyp和NaCl的耐受性
• 9.1 Hyp抗性细胞系再生植株当代对Hyp和NaCl的耐受性
• 9.2 Hyp抗性系再生植株无性后代营养生长期对Hyp和NaCl的耐受性
• 9.3 Hyp和NaCl胁迫对抗性系有性繁殖一代种子萌发的影响
• 9.3.1 Hyp和NaCl胁迫对抗性系自交一代种子相对发芽率的影响
• 9.3.2 Hyp和NaCl胁迫对抗性系自交一代种子发芽期胚根长度的影响
• 9.4 Hyp抗性系自交一代子叶诱导的次级愈伤组织对Hyp和NaCl的耐受性
• 10 小冠花Hyp抗性细胞系再生植株及其后代的生理生化特性
• 10.1 Hyp抗性系再生植株及其有性无性后代游离脯氨酸含量
• 10.2 Hyp抗性细胞系再生植株及其无性、有性后代P5CS酶活性
• 讨论
• 1 小冠花Hyp抗性变异体的离体筛选
• 2 小冠花Hyp抗性变异系生理生化特性分析
• 3 小冠花Hyp抗性变异系耐盐机理的探讨
• 4 小冠花Hyp抗性突变体真实性评价
• 参考文献
• 在读期间已发、在发和拟发的科技论文和科研成果
• 致谢