一、用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素A蛋白的研究（论文文献综述）
庄溪[1]（2013）在《酶法制备大越豆芋ACE抑制肽的研究》文中研究说明大越豆芋（Apios americana Medikus）是一种豆科植物，其块茎中的蛋白质相对高于其它块茎类植物。研究证明，大越豆芋块茎具有抑制肿瘤细胞生长，降低血压和血脂的功效。本文试以大越豆芋为原料，利用酶法生产具有ACE抑制活性的低聚肽。旨在为大越豆芋资源在国内开发利用提供更多的途径，为大越豆芋的研究提供新的思路。本文的主要内容包括以下几个方面：1.选择生产血管紧张素转化酶（angiotensin.converting enzyme, ACE）抑制肽的最佳品种的蛋白酶，之后用单因素实验对酶解条件进行初步的探索，然后通过正交实验确定酶解最佳条件。结果发现，碱性蛋白酶的酶解产物无论在水解度还是ACE抑制活性方面都明显优于其它酶。正交实验结果显示碱性蛋白酶水解大越豆芋蛋白的最佳条件是：62℃，pH8.5，底物浓度为1.2%，加酶量为3000U/g。比较酶解前后蛋白质氨基酸组成成分，发现酶解过程对豆芋蛋白的氨基酸组成成分基本没有影响，用凝胶色谱SepHadex G-25测定对水解后产物分子量分布进行观察，发现碱性蛋白酶酶解效果良好，酶解3h后产生大量分子量为5kd一下的多肽。2.对大越豆芋酶解产物进行超滤脱盐处理，发现分子量在3kda以下的低聚肽ACE抑制活性最高，进行超滤时用浓度为0.8%的溶液在250KPa下超滤一小时内效率最高。在用DA201.C大孔树脂对肽溶液脱盐过程中发现70%乙醇浓度洗脱组分的ACE抑制活性最高，其IC50为0.187mg/mL。3.对经过脱盐和超滤处理后的具有ACE抑制活性的肽进行进一步纯化，首先用DEAE-SepHarose Fast Flow阴离子交换树脂进行分离，分离产物出现三个洗脱峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通过对三个峰进行测定，发现FⅢ具有ACE抑制活性最强。将FⅢ用葡聚糖凝胶色谱进行进一步分离纯化，出现两个洗脱峰1、2其中2具有较高的ACE抑制活性，其IC50可达37.47μg/mL。4.对制得的ACE抑制肽进行理化性质的测定发现其起泡性达130%，但泡沫稳定性较差，其乳化性可达100%，8h后的乳化稳定性达到54.2%，乳化稳定性较好。在对其稳定性测定后发现，大越豆芋ACE抑制肽具有良好的热稳定性及光稳定性，对食品添加剂稳定性的测试中发现，β-环状糊精对其活性具有一定影响，其他三种对其活性影响不大。体外模拟消化实验结果表明，ACE抑制肽的IC50从38.3μg/mL升至48.1μg/mL，说明其体外消化稳定性较好。
刘蕾[2]（2011）在《坛紫菜（Porphyra haitanensis）中抑菌活性多肽的分离、初步纯化及其作用机理研究》文中研究说明本文就坛紫菜（Porphyra haitanensis）中具有抑菌活性的蛋白质酶解物进行了筛选和活性多肽初步纯化,并对其进行了作用机理研究。研究结果表明：坛紫菜水溶性蛋白质胃蛋自酶3h酶解塑对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长有明显抑制作用,将金黄色葡萄球菌确定为指示菌种。上述酶解物依次经过Labscale小型切向流超滤、Bio-Gel P-10凝胶过滤和DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析进行纯化,最终得到一个分子量段在42.9KD～80.7KD、对金黄色葡萄球菌的生长有明显抑制作用的混合多肽（DSA-1）。进一步研究发现,高温、储存时间过长、碱性环境和维生素E均降低DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力,而EDTA、维生素C、柠檬酸和DMSO会增强DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力,紫外线和金属离子K+、Na+、Ga2+、Mg2+、Fe2+对DSA-1抑制金黄色葡萄球菌生长的能力没有影响；通过对金黄色葡萄球菌生长曲线和菌落形态的研究,发现DSA-1可以抑制金黄色葡萄球菌在对数分裂期的菌体分裂,影响其菌落形态；研究经DSA-1处理的金黄色葡萄球菌培养液中物质含量的变化,发现在培养液中检测到碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶的活性和紫外吸收物的存在,并且培养液电导率值增加,说明DSA-1可能损伤了金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜,致使菌体细胞质膜通透性增加,大量胞内物质外泄；扫描电镜结果显示经DSA-1处理的金黄色葡萄球菌菌体形态逐渐变得不规则,菌体细胞表面变的粗糙,菌体细胞大多呈单个分散分布,最后大量的菌体细胞粘连成团块状；透射电镜结果进一步显示在DSA-1的作用下,金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜的完整性逐渐遭到破坏,细胞质逐渐分解固缩,胞内空腔逐渐变大,最终菌体细胞破碎；经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,DSA-1可以导致金黄色葡萄球菌菌体全蛋白谱带中某些蛋白谱带的缺失,剩余蛋白谱带也随着DSA-1处理时间的延长而逐渐变得模糊不清。因此,推测DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用机理可能是：DSA-1破坏了金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜,增强了细胞质膜通透性,导致大量胞内物质外泄,同时DSA-1也可能进入菌体细胞内部,抑制菌体细胞某些蛋白质的合成或者降解菌体细胞某些蛋白质。
陈丽[3]（2009）在《蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的分离纯化及其性质研究》文中指出蜜蜂白垩病（Honeybee chalkbrood disease）,是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的蜜蜂幼虫的真菌传染病。毒力是决定病原菌侵染力的重要指标,病原真菌在侵染机体过程中所分泌一些能降解体壁或组织的蛋白酶与真菌毒力有密切关系。有研究已经证明丝氨酸蛋白酶是真菌侵染无脊椎动物过程中的一个关键酶,是致病性决定因子。因此,系统研究蜜蜂球囊菌分泌的类丝氨酸蛋白酶,能够使我们更好的了解真菌入侵机制,从而为进一步防治该病打下基础。本文在其他研究者的基础上建立了一套比较简便易行、提取效果好、成本较低的从蜜蜂球囊菌发酵液中纯化胞外蛋白酶的流程。从蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的粗酶液中分离出一种类丝氨酸蛋白酶,并对其理化性质作了初步研究。10株来源不同的蜜蜂球囊菌接种于酪蛋白诱导培养基平板上,将产酶量较大的菌株ND-2作后期试验菌株。采用正交试验法得出用（NH4）2SO4沉淀法浓缩蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的最终粗提条件为:Tris缓冲液浓度为20 mmol/L,缓冲液pH值为7.8,（NH4）2SO4浓度为80%。蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的6天发酵液经80%硫酸铵沉淀,DEAE-Sapharose Fast Flow离子交换层析（00.5 mol/L NaCl线性梯度洗脱）,Sephadex G-75凝胶层析,获得一种类丝氨酸蛋白酶,比活由1.9 U/mg提高到345.7 U/mg,纯化倍数为181.9倍,回收率为5.7%。提纯后的蛋白酶用SDS-PAGE电泳检测,分子量大约为29.5 kDa,命名为pro-AAND-2。金属离子及抑制剂对蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性的影响研究,结果表明:Cu2+和Fe3+对蛋白酶的活性有较强的抑制作用,在Ag+、Cu2+的浓度分别达到20 mmol/L和50 mmol/L时均可使蛋白酶的活性完全失去,胰蛋白酶抑制剂PMSF能强烈抑制该酶活性,当PMSF浓度为10 mmol/L时基本检测不到该酶活性,表明它可能是一种丝氨酸蛋白酶。最适反应温度和最适反应pH分别为55℃和7.0,在pH 3.0～11.0的广范围内比较稳定,但热稳定性随着温度的升高,其活性丧失的越多,热稳定性越差。
王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕[4]（2007）在《皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建》文中提出提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A（Hypodermin A,HA）基因片段,用XhoⅠ、XbaⅠ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的载体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确。
高兴春,徐梅倩,何国声[5]（2007）在《皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化》文中认为利用PCR技术从重组质粒pGEM-T/HC中扩增HCcDNA片段,克隆到pPIC9k毕赤酵母表达载体中,获得重组质粒pPIC9k-HC,重组质粒线性化后电激转化入毕赤酵母GS115菌株中,重组子经G418筛选、PCR鉴定得到含外源基因的重组子,然后在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28kD,表达量约为121mg/L,表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化,所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力;明胶电泳检测显示具有水解酶活性,为今后进行大规模的牛皮蝇蛆病的调查提供了一种生产大量廉价抗原的方法。
高兴春[6]（2007）在《毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白及牛皮蝇蛆病诊断技术的研究》文中研究指明皮蝇素C（Hypodermin C，HC）是皮蝇第一期幼虫在宿主体内移行过程中分泌的一种丝氨酸蛋白酶，对皮蝇有很高的抗原性和特异性，是一种理想的检测抗原。本文首次建立了用毕赤酵母表达系统表达重组HC蛋白的技术，对表达产物进行了生物特性的鉴定，对表达条件进行了优化研究。将经PCR扩增出的HC基因连接到毕赤酵母一大肠杆菌穿梭质粒pPIC9k上，构建重组转移质粒pPIC9k-HC，测序鉴定插入序列。重组质粒线性化后，通过电激转化入酵母细胞GS115中，用组氨酸缺陷培养基筛选含重组质粒的克隆，用含1.0mg／mlG418的YPD培养基筛选含多拷贝质粒的克隆。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌产生目的蛋白，培养60小时后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28 KD，表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化，所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力；明胶电泳检测显示具有水解酶活性。单因素改变表达条件的优化试验结果表明，当甲醇浓度为1.0％，甘油浓度为0.25％，pH值为6.0，诱导60h的情况下表达产量最高，表达量约为121 mg／L，显着高于其他表达方法。用表达纯化的蛋白作为检测抗原，进行了牛皮蝇蛆病ELISA诊断方法的研究：通过对ELISA反应条件的系列摸索，确定了各组分的最适工作条件：抗原的最适浓度为1μg／ml，最佳封闭条件是5％脱脂乳37℃封闭3h，血清的稀释度为1：50，作用时间是37℃2h，二抗的最佳稀释度为1：2000，作用时间是37℃1h，底物在37℃显色10min，根据己经建立的ELISA方法及反应条件，确定阴阳性临界值为0.21。初步研究表明纯化的蛋白具有很好的抗原性，建立的ELISA方法具有较高的特异性，为试剂盒的研制打下了良好的基础。
高兴春,郭敏,徐梅倩,何国声[7]（2006）在《用毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白的研究》文中提出牛皮蝇蛆病（Hypodermosis）是由双翅目皮蝇科皮蝇属的皮蝇幼虫引起的一种寄生虫病,通过在家畜体内移行和背部穿孔带来危害。皮蝇素C（Hypodermin C,HC）一种后生动物起源的昆虫胶原酶,分子量是 25．223 Da,成熟的HC含有230个氨基酸,比其前体少了30个氨基酸,整个氨基酸序列和胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有高度的同源性。HC只在一期幼虫中表达,能在牛背上形成瘤包的二期和三期幼虫不表达HC。HC对皮蝇属有很高的抗原性和特异性。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种价廉高产的表达系统,可能会成为获得足够的重组HC蛋白的方法。
孙怡,徐梅倩,高兴春,何国声[8]（2006）在《毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白》文中指出建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（HypodermotinA,HA）的技术,并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上,构建了重组转移质粒pPIC9k-HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,培养3d后收取上清,用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western-blotting表明,该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示,该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明,甲醇浓度在0.5%1%、溶氧量在70%以上、诱导23d的情况下表达产量最高,达1500mg/L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。
张美红[9]（2006）在《黄鳝胰蛋白酶的纯化及动力学性质的研究》文中提出胰蛋白酶是消化酶的一种，属于丝氨酸蛋白酶家族，对鱼类食物蛋白质的消化具有重要的生理作用。胰蛋白酶来源于鱼类的胰脏、肠道和幽门盲囊。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类胰脏中，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。黄鳝是我国主要的名优淡水鱼类养殖品种之一，其营养丰富、肉质鲜美，进行规模化养殖具有广阔的发展前景。黄鳝胰蛋白酶的相关研究可为黄鳝饲养的饲料配给提供相关信息，也可为一直作为下脚料的黄鳝内脏的合理回收利用提供理论基础。可是到目前为止，还未见黄鳝胰蛋白酶分离纯化及其性质方面的研究报道。本研究主要是对黄鳝胰蛋白酶进行分离纯化，并对其动力学性质进行了分析研究，具体研究如下： 1．黄鳝胰蛋白酶的纯化研究 将黄鳝在冰盘上解剖，取出肝胰脏，用预冷单蒸水淋洗，再用纱布将其沥干，加入四倍体积的pH8.0 50mM Tris-HCl缓冲液（含0.02％叠氮化钠）中，用搅拌机打碎成稀糊状液。4℃静置过夜后离心（15000 g×40min），过滤取上清液。然后将胰蛋白酶粗提液在4℃按饱和度30％、40％、50％、60％、70％、100％逐步进行硫酸铵分级沉淀，确定出胰蛋白酶的最佳硫酸铵沉淀饱和度范围为30％～60％。收集30％～60％的硫酸铵沉淀，用适量的提取液溶解后，在同样的缓冲液中透析过夜。 离子交换填料采用Amersham公司的DEAE-SepharoseTM Fast Flow，装入层析柱（1.2×20cm）中，先用大约100ml的50mM、pH7.0 Tris-HCl缓冲液以8-10ml／min的速度平衡DEAE-SepharoseTM Fast Flow柱，然后将透析过夜后的酶液上柱于DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析柱，再用相同的缓冲液冲洗掉未结合的蛋白质。用50mM、pH7.0 Tris-HCl缓冲液（含0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.3M NaCl、0.4M NaCl、0.5M NaCl）分别进行洗脱，收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰，进行下一步纯化。 亲和层析采用的是5mL HiTrap Benzamidine FF（high sub）亲和预装柱。先用5个柱床体积（25ml）pH8.0 0.05M Tris-HCl缓冲液（含0.5M NaCl）以2mL／min的流速平衡。待基线为0.02以下时，然后以2mL／min的流速上样。再用5-10个柱床体积的平衡液冲洗，洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。经实验研究，选择用pH3.0 50mM甘氨酸-HCl亲和洗脱液以5mL／min的速度洗脱，收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰，每毫升加60-200ul pH 9.0 1M Tris-HCl调节其pH值，以保持酶的稳定。 用5％的浓缩胶和12％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，黄胰蛋白酶呈现出单一条带。并测得胰蛋白酶的分子量约为26.8KDa。通过测定每一分离纯化步骤所得胰酶样品的活力及比活力（以TAME为底物），黄鳝胰蛋白酶的纯化倍数达到约900倍，比活力为538 U／mg，最终产率为14.6％。
孙怡,何国声,徐梅倩,曹杰,朱顺海,黄燕,高兴春[10]（2006）在《重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验》文中研究表明用由毕赤酵母表达的皮蝇素A（Hypderm in A,HA）蛋白分别免疫新西兰大白兔和牦牛,了解该蛋白免疫效果。用两种不同分子量的重组HA蛋白分别免疫新西兰大白兔1次和2次,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,3周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好,差异非常显着（P<0.01）。用其中50KD的重组HA蛋白分别在7月和9月免疫自然感染牛皮蝇蛆病牦牛,观察感染率和感染强度,ELISA测其抗体消长规律。结果表明,7月免疫组与9月免疫组感染率分别为83.3%和36.3%（对照组为55.5%）;平均感染强度分别为6.5和4.2（对照组为13.0）,差异不显着（P>0.05）。免疫后,抗体水平上升,3个月后缓慢下降。9月免疫组免疫效果较7月免疫组好,三组抗体水平差异非常显着（P<0.01）。上述研究结果为防治牛皮蝇蛆病疫苗的深入研究和实践运用提供了参考依据。
二、用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素A蛋白的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素A蛋白的研究（论文提纲范文）
（1）酶法制备大越豆芋ACE抑制肽的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 大越豆芋国内外研究现状 |
| 1.1.1 大越豆芋简介 |
| 1.1.2 大越豆芋的国外研究现状 |
| 1.1.3 大越豆芋的国内研究现状 |
| 1.2 高血压与血管紧张素转换酶 |
| 1.2.1 高血压的简介 |
| 1.2.2 高血压的治疗 |
| 1.2.3 血管紧张素转换酶 |
| 1.3 低聚肽的介绍 |
| 1.3.1 低聚肽的简介 |
| 1.3.2 低聚肽的生理活性 |
| 1.4 立题背景及意义 |
| 1.5 本论文主要的研究内容 |
| 2 大越豆芋蛋白的酶解工艺研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 主要设备与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大越豆芋蛋白的制备方法 |
| 2.3.2 蛋白酶品种的选择 |
| 2.3.3 热处理对酶解效果的影响 |
| 2.3.4 碱性蛋白酶水解大越豆芋条件优化 |
| 2.3.4.1 温度对酶解效果的影响 |
| 2.3.4.2 pH 对酶解效果的影响 |
| 2.3.4.3 底物浓度对酶解效果的影响 |
| 2.3.4.4 加酶量对酶解效果的影响 |
| 2.3.4.5 酶解正交优化试验设计 |
| 2.3.5 溶液中蛋白质含量的测定 |
| 2.3.6 水解度的测定 |
| 2.3.7 ACE 抑制活性的测定方法 |
| 2.3.8 氨基酸组成分析的测定 |
| 2.3.9 凝胶色谱法观察时间对酶解效果的影响 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 酶法制备豆芋蛋白 ACE 抑制肽不同酶品种的选则 |
| 2.4.2 热处理对酶解效果的影响 |
| 2.4.3 温度对酶解效果的影响 |
| 2.4.4 pH 对酶解效果的影响 |
| 2.4.5 底物浓度对酶解效果的影响 |
| 2.4.6 加酶量对酶解效果的影响 |
| 2.4.7 碱性蛋白酶水解大越豆芋蛋白的正交试验 |
| 2.4.8 碱性蛋白酶水解前后氨基酸成分对比 |
| 2.4.9 凝胶色谱观察酶解效果随时间的变化 |
| 2.5 小结 |
| 3 酶解产物的脱盐和超滤工艺研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.2.1 试验材料与试剂 |
| 3.2.2 主要设备与仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 酶解产物的超滤方法 |
| 3.3.2 超滤膜的选择 |
| 3.3.3 超滤溶液浓度对超滤效率的影响 |
| 3.3.4 超滤压力对超滤效率的影响 |
| 3.3.5 大孔吸附树脂 DA201-C 对酶解产物的脱盐作用研究 |
| 3.3.5.1 大孔树脂的预处理 |
| 3.3.5.2 不同浓度梯度乙醇的分级洗脱 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同规格超滤膜进行超滤对产物 ACE 抑制活性的影响 |
| 3.4.2 底物浓度对膜通量的影响 |
| 3.4.3 压力对超滤膜通量的影响 |
| 3.4.4 大孔吸附树脂乙醇分级洗脱 |
| 3.4.5 不同乙醇梯度下洗脱产物 ACE 抑制活性的比较 |
| 3.5 小结 |
| 4 ACE 抑制肽的分离纯化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 试验材料与试剂 |
| 4.2.2 主要设备与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 凝胶的预处理 |
| 4.3.2 DEAE-SepHarose Fast Flow 分离纯化 ACE 抑制肽 |
| 4.3.3 SepHadex G-15 分离纯化 ACE 抑制肽 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 DEAE-SepHarose Fast Flow 的纯化结果 |
| 4.4.2 SepHadex G-15 的纯化结果 |
| 4.5 小结 |
| 5 大越豆芋 ACE 抑制肽理化性质的测定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和仪器 |
| 5.2.1 试验材料与试剂 |
| 5.2.2 主要设备与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ACE 抑制肽发泡性及泡沫稳定性的测定 |
| 5.3.2 ACE 抑制肽乳化性和乳化稳定性的测定 |
| 5.3.3 ACE 抑制肽稳定性的测定 |
| 5.3.3.1 热稳定性的测定 |
| 5.3.3.2 对食品添加剂稳定性的测定 |
| 5.3.3.4 光照稳定性的测定 |
| 5.3.3.5 体外消化稳定性的测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 大越豆芋 ACE 抑制肽的发泡性及其发泡稳定性 |
| 5.4.2 大越豆芋 ACE 抑制肽的乳化性及乳化稳定性 |
| 5.4.3 ACE 抑制肽的稳定性的测定结果 |
| 5.5 小结 |
| 6 主要结论及展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（2）坛紫菜（Porphyra haitanensis）中抑菌活性多肽的分离、初步纯化及其作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 坛紫菜中不同溶解度蛋白质的分离及其抑菌活性酶解物的制备 |
| 1.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 坛紫菜中水溶性、盐溶性和碱溶性蛋白质的分离 |
| 1.2.2 坛紫菜中3种不同溶解度蛋白质抑菌活性的测定 |
| 1.2.3 坛紫菜蛋白质5种蛋白酶酶解物的制备 |
| 1.2.4 坛紫菜蛋白质5种酶解物抑菌活性的测定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 坛紫菜抑菌活性多肽的初步纯化 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 坛紫菜抑菌活性酶解物的超滤分级 |
| 2.2.2 Bio-Gel P-10凝胶过滤层析 |
| 2.2.3 DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 LabScale小型切向流超滤系统纯化结果 |
| 2.3.2 Bio-Gel P-10凝胶过滤纯化结果 |
| 2.3.2.1 LTS-1光谱扫描结果 |
| 2.3.2.2 LTS-1经Bio-Gel P-10凝胶过滤纯化结果 |
| 2.3.3 DEAE SephadexA-50阴离子交换层析纯化结果 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 坛紫菜DSA-1多肽抑菌活性影响因素的研究 |
| 3.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 温度对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.2 pH对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.3 有机酸对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.4 维生素对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.5 储藏时间对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.6 紫外线处理对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.2.7 常见金属离子对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 温度对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.2 pH对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.3 有机酸对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.4 维生素对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.5 储存时间对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.6 紫外线处理对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.3.7 常见金属离子对DSA-1多肽抑菌活性的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 坛紫菜多肽DSA-1抑菌机理的研究 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体生长曲线的影响 |
| 4.2.2 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌落形态的影响 |
| 4.2.3 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞壁通透性的影响 |
| 4.2.4 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞膜通透性的影响 |
| 4.2.4.1 电导率的测定 |
| 4.2.4.2 紫外吸收物的测定 |
| 4.2.4.3 β-半乳糖苷酶活性的测定 |
| 4.2.5 DSA-1对金黄色葡萄球菌作用后菌体扫描电镜和透射电镜观察 |
| 4.2.5.1 扫描电镜样品制备 |
| 4.2.5.2 透射电镜样品制备 |
| 4.2.6 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体表达蛋白质的影响 |
| 4.2.7 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体基因组DNA的影响 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体生长曲线的影响 |
| 4.3.2 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌落形态的影响 |
| 4.3.3 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞壁通透性的影响 |
| 4.3.4 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体细胞膜通透性的影响 |
| 4.3.4.1 电导率的测定结果 |
| 4.3.4.2 紫外吸收物的测定结果 |
| 4.3.4.3 β-半乳糖苷酶的活性测定结果 |
| 4.3.5 DSA-1对金黄色葡萄球菌作用后菌体扫描电镜和透射电镜观察 |
| 4.3.5.1 扫描电镜观察结果 |
| 4.3.5.2 透射电镜观察结果 |
| 4.3.6 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体表达蛋白质的影响 |
| 4.3.7 DSA-1对金黄色葡萄球菌菌体基因组DNA的影响 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的分离纯化及其性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 第一章 综述 |
| 1 蜜蜂白垩病研究进展 |
| 1.1 病原及其病原生物学特性的研究 |
| 1.2 病原培养条件的研究 |
| 1.3 防治方面的研究 |
| 1.3.1 科学的饲养管理 |
| 1.3.2 药物防治 |
| 1.3.3 蜜蜂抗病育种的研究 |
| 2 胞外蛋白酶的研究 |
| 2.1 蛋白酶的种类 |
| 2.2 丝氨酸蛋白酶为致病的决定因子 |
| 2.3 蛋白酶活性测定的研究 |
| 2.4 分离纯化技术的研究概况 |
| 2.4.1 粗分离法 |
| 2.4.2 沉淀法 |
| 2.4.3 透析 |
| 2.4.4 液相色谱 |
| 2.4.5 超滤 |
| 2.4.6 离子交换层析 |
| 2.4.7 疏水层析 |
| 2.4.8 亲和层析 |
| 2.4.9 凝胶过滤层析 |
| 3 本试验的研究背景及意义 |
| 第二章 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的纯化 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂和溶液 |
| 1.3.1 筛选分泌胞外酶菌株所用试剂 |
| 1.3.2 蛋白酶活性测定所用试剂 |
| 1.3.3 蛋白质含量测定所用试剂 |
| 1.3.4 离子交换层析缓冲液 |
| 1.3.5 SDS-PAGE 电泳试剂 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 分泌胞外酶菌株的筛选 |
| 2.2 蜜蜂球囊菌的培养 |
| 2.2.1 马铃薯酵母培养基的制备 |
| 2.2.2 倒平板 |
| 2.2.3 接菌 |
| 2.2.4 液体培养基的制备 |
| 2.2.5 液体培养 |
| 2.2.6 粗酶液的准备 |
| 2.3 胞外产物蛋白质含量测定 |
| 2.3.1 实验原理 |
| 2.3.2 蛋白质含量的测定方法 |
| 2.4 蛋白酶活性检测 |
| 2.5 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶产量与时间的关系 |
| 2.6 正交实验选择(NH_4)_2SO_4沉淀法的处理条件 |
| 2.7 硫酸铵沉淀 |
| 2.8 DEAE-Sapharose Fast Flow 离子交换层析 |
| 2.8.1 预处理 |
| 2.8.2 装柱 |
| 2.8.3 平衡 |
| 2.8.4 上样与洗脱 |
| 2.8.5 再生与清洗 |
| 2.9 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 |
| 2.9.1 Sephadex G-75 凝胶预处理 |
| 2.9.2 装柱 |
| 2.9.3 平衡 |
| 2.9.4 上样与洗脱 |
| 2.9.5 再生与清洗 |
| 2.10 SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳及相对分子量测定 |
| 2.10.1 装板 |
| 2.10.2 灌注分离胶 |
| 2.10.3 灌注浓缩胶 |
| 2.10.4 安装电泳装置上样 |
| 2.10.5 电泳 |
| 2.10.6 凝胶的染色 |
| 2.10.7 凝胶的脱色 |
| 2.10.8 凝胶成像 |
| 2.10.9 计算分子量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株产酶情况的观察 |
| 3.2 牛血清白蛋白浓度标准曲线 |
| 3.3 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活力与时间的关系 |
| 3.4 正交试验结果方差分析表 |
| 3.5 离子交换层析结果 |
| 3.5.1 离子交换层析样品的制备 |
| 3.5.2 离子交换层析 |
| 3.6 凝胶过滤层析结果 |
| 3.7 分子量测定 |
| 3.8 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶纯化结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 理化性质的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 原料 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 温度对酶活性影响 |
| 2.1.1 最适温度 |
| 2.1.2 热稳定性 |
| 2.2 pH 对酶活力影响 |
| 2.2.1 最适pH 值测定 |
| 2.2.2 pH 稳定性 |
| 2.3 金属离子对酶活力影响 |
| 2.4 抑制剂对酶活力影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 温度对酶活性影响 |
| 3.1.1 最适温度 |
| 3.1.2 酶的热稳定性 |
| 3.2 pH 对酶活性影响 |
| 3.2.1 pH 对酶的影响 |
| 3.2.2 酶对不同pH 的耐受性 |
| 3.3 金属离子对酶活力影响 |
| 3.4 抑制剂对酶活力影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白及牛皮蝇蛆病诊断技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 牛皮蝇蛆病概述 |
| 1.1.1 牛皮蝇的分类 |
| 1.1.2 牛皮蝇的生活史 |
| 1.1.3 牛皮蝇蛆病的流行及危害 |
| 1.2 牛皮蝇蛆病的诊断 |
| 1.2.1 临床诊断 |
| 1.2.2 免疫学诊断 |
| 1.3 牛皮蝇蛆病的预防与治疗 |
| 1.3.1 牛皮蝇蛆病的预防 |
| 1.3.2 牛皮蝇蛆病的治疗 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验器材 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要工具酶 |
| 2.1.5 主要溶液的配制 |
| 2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.1 HC基因的扩增 |
| 2.2.2 PCR产物的电泳检测和回收 |
| 2.2.3 纯化PCR产物和pMD18-T载体连接 |
| 2.2.4 重组载体pMD18-T/HC的转化 |
| 2.2.5 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.6 重组质粒pPIC9k-HC的构建 |
| 2.2.7 重组质粒pPIC9k-HC的转化及鉴定 |
| 2.3 重组质粒的转化和筛选 |
| 2.3.1 重组质粒的转化 |
| 2.3.2 含多拷贝重组质粒菌株的筛选 |
| 2.4 蛋白诱导分泌 |
| 2.5 表达产物的生物特性鉴定 |
| 2.5.1 分子量测定 |
| 2.5.2 抗原性检测 |
| 2.5.3 酶活性检测 |
| 2.6 目的蛋白的分离和纯化 |
| 2.7 表达条件优化的研究 |
| 2.7.1 甲醇浓度对HC表达的影响 |
| 2.7.2 甘油浓度对HC表达的影响 |
| 2.7.3 培养基pH值对HC表达的影响 |
| 2.7.4 蛋白浓度检测 |
| 2.8 诊断技术的研究 |
| 2.8.1 间接ELISA的操作程序 |
| 2.8.2 ELISA最佳工作条件的确定 |
| 2.8.3 交叉反应试验 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 结果 |
| 3.1.1 HC基因的克隆、表达、纯化和鉴定 |
| 3.1.2 表达条件优化的研究 |
| 3.1.3 诊断技术的研究 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 多种表达系统表达HC蛋白的比较 |
| 3.2.2 关于毕赤酵母表达HC蛋白的研究 |
| 3.2.3 关于HC蛋白生物活性的研究 |
| 3.2.4 牛皮蝇蛆病诊断技术的研究 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 重组质粒的构建 |
| 1.1.1 HA基因的扩增 |
| 1.1.2 pPIC9k-HA的构建 |
| 1.1.3 重组质粒的鉴定 |
| 1.2 重组质粒的转化和筛选 |
| 1.2.1 重组质粒的转化 |
| 1.2.2 多拷贝重组质粒的筛选 |
| 1.3 细胞培养与蛋白诱导分泌 |
| 1.4 分离纯化 |
| 1.5 表达产物的生物学特性鉴定 |
| 1.5.1 分子量测定 |
| 1.5.2 抗原性检测 |
| 1.5.3 酶活性检测 |
| 1.6 表达条件的优化[10-11] |
| 1.6.1 甲醇浓度对HA表达的影响 |
| 1.6.2 溶氧量对HA表达的影响 |
| 1.6.3 诱导时间对HA表达的影响 |
| 1.7 蛋白浓度检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体的构建和鉴定 |
| 2.2 重组质粒的筛选 |
| 2.3 蛋白的诱导表达 |
| 2.4 阴离子交换层析分离纯化 |
| 2.5 表达产物的生物学特性鉴定 |
| 2.5.1 抗原性鉴定 |
| 2.5.2 酶活性鉴定 |
| 2.6 表达条件的优化 |
| 2.6.1 甲醇浓度对HA表达的影响 |
| 2.6.2 溶氧量对HA表达的影响 |
| 2.6.3 诱导时间对HA表达的影响 |
| 2.7 蛋白浓度计算 |
| 3 讨论 |
（9）黄鳝胰蛋白酶的纯化及动力学性质的研究（论文提纲范文）
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 黄鳝的研究概况 |
| 1.1.1 黄鳝繁殖生物学的研究 |
| 1.1.2 黄鳝性逆转现象的研究 |
| 1.1.3 黄鳝年龄与生长的研究 |
| 1.1.4 黄鳝消化酶的研究 |
| 1.1.5 黄鳝食性的研究 |
| 1.1.6 黄鳝人工养殖的研究 |
| 1.2 胰蛋白酶的研究概况 |
| 1.2.1 胰蛋白酶分离纯化的研究 |
| 1.2.2 胰蛋白酶特性的研究 |
| 1.2.3 胰蛋白酶应用的研究 |
| 1.3 分离纯化技术的研究概况 |
| 1.3.1 材料的预处理 |
| 1.3.2 粗分离法 |
| 1.3.3 液相色谱 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 黄鳝粗胰蛋白酶的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞破碎 |
| 3.1.2 硫酸铵分级沉淀 |
| 3.1.3 透析 |
| 3.1.4 胰蛋白酶活性的测定 |
| 3.1.5 蛋白质含量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 硫酸铵盐析最佳浓度的确定 |
| 3.2.4 牛血清白蛋白浓度标准曲线 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 粗胰酶的提取 |
| 3.3.2 硫酸铵沉淀 |
| 3.3.3 考马斯亮兰与试剂盒两种方法测量蛋白含量的比较 |
| 第4章 黄鳝胰蛋白酶的纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 离子交换层析 |
| 4.1.2 亲和层析 |
| 4.1.3 胰蛋白酶分子量的测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 离子交换层析谱图 |
| 4.2.2 亲和层析谱图 |
| 4.2.3 黄鳝胰蛋白酶的分子量 |
| 4.2.4 黄鳝胰蛋白酶的纯化结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 纯化方法的比较 |
| 4.3.2 离子交换层析 |
| 4.3.3 亲和层析 |
| 4.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 4.3.5 胰蛋白酶的分子量 |
| 第5章 黄鳝胰蛋白酶动力学性质的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 动力学常数(Km)的测定 |
| 5.1.2 胰蛋白酶最适温度的测定 |
| 5.1.3 胰蛋白酶最适pH的测定 |
| 5.1.4 胰蛋白酶热稳定性的研究 |
| 5.1.5 胰蛋白酶酸碱稳定性的研究 |
| 5.1.6 金属离子和EDTA对胰蛋白酶活性影响的研究 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 黄鳝胰蛋白酶的动力学常数 |
| 5.2.2 黄鳝胰蛋白酶的最适温度 |
| 5.2.3 黄鳝胰蛋白酶的最适pH |
| 5.2.4 黄鳝胰蛋白酶的热稳定性 |
| 5.2.5 黄鳝胰蛋白酶的酸碱稳定性 |
| 5.2.6 金属离子和EDTA对胰蛋白酶活性的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 胰蛋白酶的动力学常数 |
| 5.3.2 胰蛋白酶的最适温度和热稳定性 |
| 5.3.3 胰蛋白酶的最适pH和酸碱稳定性 |
| 5.3.4 金属离子和EDTA对胰蛋白酶活性的影响 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩写词 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文一览表 |
（10）重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 新西兰大白兔免疫试验 |
| 1.2.1 取5只新西兰大白兔, 分别标记A、B、C、D、E。 |
| 1.2.2 血清的采集 |
| 1.2.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 1.3 牦牛免疫保护试验 |
| 1.3.1 取36头甘肃省甘南地区自然感染牛皮蝇蛆牦牛, 随机分为3组, 分别标记A组、B组、C组。 |
| 1.3.2 血清的采集 |
| 1.3.3 蝇蛆瘤包的观察 |
| 1.3.4 酶联免疫吸附试验 (ELISA) |
| 2 结果 |
| 2.1 新西兰大白兔免疫试验 |
| 2.2 牦牛免疫保护试验 |
| 3 讨论 |
四、用阴离子交换层析纯化牛皮蝇素A蛋白的研究（论文参考文献）
- [1]酶法制备大越豆芋ACE抑制肽的研究[D]. 庄溪. 浙江农林大学, 2013(05)
- [2]坛紫菜（Porphyra haitanensis）中抑菌活性多肽的分离、初步纯化及其作用机理研究[D]. 刘蕾. 青岛大学, 2011(03)
- [3]蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的分离纯化及其性质研究[D]. 陈丽. 福建农林大学, 2009(12)
- [4]皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建[J]. 王艳华,殷宏,罗建勋,蒋锡仕. 动物医学进展, 2007(09)
- [5]皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化[J]. 高兴春,徐梅倩,何国声. 生物工程学报, 2007(03)
- [6]毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白及牛皮蝇蛆病诊断技术的研究[D]. 高兴春. 中国农业科学院, 2007(06)
- [7]用毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白的研究[A]. 高兴春,郭敏,徐梅倩,何国声. 中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集, 2006
- [8]毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白[J]. 孙怡,徐梅倩,高兴春,何国声. 中国兽医学报, 2006(03)
- [9]黄鳝胰蛋白酶的纯化及动力学性质的研究[D]. 张美红. 西南大学, 2006(11)
- [10]重组牛皮蝇素A蛋白的免疫试验[J]. 孙怡,何国声,徐梅倩,曹杰,朱顺海,黄燕,高兴春. 中国兽医寄生虫病, 2006(02)