聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价

论文题目: 聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价

论文类型: 博士论文

论文专业: 药剂学

作者: 陈钧

导师: 蒋新国,卢建忠,蒋晨

关键词: 呼吸道免疫,疫苗,递释系统,聚乙烯亚胺,聚乙二醇,主动靶向,结核病,利扎曲普坦,鼻腔喷雾剂,鼻粘膜给药,脑内递药,偏头痛

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文研究内容包括两个部分，第一部分为聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价；第二部分为苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究。 第一部分 聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价 21世纪的今天，人类依然面临着传染病的巨大威胁。呼吸道免疫能同时诱导系统和粘膜免疫应答，对有效控制和消灭传染病特别是呼吸系统感染具有十分重要的意义。DNA疫苗具有诱导体液免疫和细胞免疫的能力，而且制备简便，稳定性好，因此DNA疫苗经呼吸道免疫可望为呼吸道传染病的防治带来希望。但目前该方面的研究还处于初期阶段，其症结所在是缺乏高效低毒的DNA疫苗递释系统。病毒载体虽然高效，但其安全性存在极大隐患，而且载体的构建成本非常昂贵，目的基因容量小、靶向特异性差。所以研究开发高效、安全的非病毒载体是当今基因治疗的重要发展方向。但是，非病毒载体最大的缺陷是转染效率低，不能产生有意义的蛋白表达。本研究针对DNA进入细胞表达蛋白（抗原）的主要障碍，即胞外屏障和胞内屏障，设计了三种新型的基于聚乙烯亚胺（PEI）的DNA疫苗非病毒载体，并以结核分支杆菌抗原Ag85B基因为目的基因，评价了三种基因递释系统经鼻腔给药后的免疫效果。 第一章将结核分支杆菌抗原Ag85B基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.0中，构建成重组pcDNA85b，为了提高该疫苗的免疫原性，在该质粒中插入组织纤维蛋白溶酶原激活因子（tPA）信号序列，由此构建成能在哺乳动物细胞中获得高效表达的结核杆菌DNA疫苗—pcDNA85btPA，并且通过酶解和测序鉴定了其构建的准确性。 第二章针对PEI／DNA复合物溶解性差的问题，将PEI进行不同程度的聚乙二醇（PEG）修饰（每个PEI分子接枝1、2、5、10和20个PEG），以期增加复合物溶解度，减少相互聚集以及与体液中蛋白的相互作用。为了考察PEG化对PEI／DNA性质的影响，通过凝胶电泳阻滞分析和包封率测定，评价了PEG化的PEI与DNA的结合情况，采用MTT法评价复合物的细胞毒性。结果表明：PEI在PEG化后其与DNA的结合有不同程度的降低，但其复合物的毒性降低。体内外转染实验证明，PEI在PEG化后的转染效率随着PEG接枝率的增加而降低，但在比较低接枝率（即每个PEI分子接枝1个或2个PEG）的情况下，调整N／P值，仍能得到较为理想的体内外转染效率。体外转染结果表明PEI-PEG-1／DNA复合物在N／P为9时，PEI-PEG-2／DNA复合物在N／P为12时的转染效果与PEI／DNA复合物最佳转染效果相似，但在体内应用时前两者体现了一定优势，其转染效率分别是PEI／DNA复合物N／P为9时的2.35倍和2.29倍，存在极显著性差异（P＜0.01），这是因为PEG的隐形作用使其在体内应用显示优势。 第三章利用呼吸道细胞膜上存在凝集素，能特异地与糖基结合的特性，采用具有双功能基团的N-hydroxysuccinimide-PEG-Maleimide （NHS-PEG-MAL），NHS一端专属性地与氨基半乳糖上的氨基结合，MAL一端专属性地与PEI分子多胺中的氨基结合。凝胶阻滞和包封率测定等实验证明PEI分子在修饰0.5％，1％，5％mol／mol糖基后，其与DNA的结合作用降低，但调整N／P值后其与DNA的结合仍较牢固；另外在PEI分子中引入了糖基和PEG的亲水链后，其细胞毒性大大降低。将Gala-PEG-PEI／DNA复合物分别转染16HBE14O细胞（细胞膜上有凝集素表达）和NIH 3T3细胞（细胞膜上无凝集素表达），体外转染结果证明1％Gala-PEG-PEI／DNA在N／P为36时的转染效率是PEI／DNA在N／P为6时的3.1倍，而在没有凝集素的NIH 3T3细胞上，该复合物的转染效率却仅为PEI／DNA的0.06倍。可见，Gala-PEG-PEI／DNA复合物确实通过受体介导进入细胞，增加了转染效果。体内实验也充分显示了PEG化的优势，1％的Gala-PEG-PEI／DNA在N／P为24，36和48时的转染效率分别为PEI／DNA在N／P为9时的3.0、11.6和6.7倍。 第四章针对DNA载体系统不能有效进入细胞膜或进入膜后易在溶酶体环境下降解失活及不能有效进入细胞核的问题，以人体免疫缺陷病毒（HIV）的蛋白转导域Tat蛋白修饰PEI，该蛋白具有直接穿过细胞膜或者促进溶酶体破坏功能，此外Tat蛋白具有一段核定位序列（Nuclear Localization Sequence，NLS），可以增加外源基因转运入细胞核，提高转染效果。本研究首先将Tat蛋白PEG化，即将Tat蛋白中的巯基与mPEG-MAL反应，使MAL一端专属性地与Tat蛋白中的巯基结合，该载体引入PEG的长链后能防止Tat蛋白与DNA形成复合物时相互聚集；然后将PEG化的Tat蛋白与DNA在一定质量比的条件下反应，通过正负电荷的相互吸引形成复合物，再将该复合物与带阳离子的PEG化的PEI结合，形成三元复合物。包封率测定证明PEI在修饰Tat蛋白后其与DNA的结合作用没有降低。体内外转染实验表明，Tat蛋白修饰PEI后能够增加转染效率，PEI-PEG-1／PEG-Tat-1／DNA在N／P为9时的转染效率为PEI-PEG--1／DNA在N／P为9时的2.81倍；其体内转染效率为后者的2.01倍，存在显著性差异（P＜0.05）。但蛋白的修饰方法和修饰量应进一步优化，以期获得更高的表达。第五章对上述三种修饰的PEI／pcDNA85btPA复合物的免疫效果进行初步评价。采用鼻腔给药途径免疫BALB／c小鼠，研究了四种基于PEI（其中一种为未修饰的PEI，其它三种分别为采用上述三种方法修饰的PEI在动物体内得到最高表达的载体）的非病毒载体递送pcDNA85btPA疫苗诱导的体液免疫（包括粘膜免疫）和细胞免疫情况，初步评价疫苗的免疫效果。结果显示三种基因载体复合物均诱导较强的系统IgG、局部粘膜IgA，特异性淋巴细胞增殖和较强的IFN-γ水平，表明三种复合物均具有载DNA疫苗进入动物体内表达目的蛋白，同时诱导体液免疫（包括系统和局部）和细胞免疫应答的能力。Gala-PEG-PEI／pcDNA85btPA复合物、PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA复合物诱导的免疫应答水平均显著高于PEI／pcDNA85btPA复合物和PEI-PEG-1／pcDNA85btPA复合物，特别是PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA复合物诱导的粘膜免疫水平显著高于其他组，将有望在呼吸道感染性疾病的防治中起到一定作用。 第六章对几种修饰的PEI／DNA复合物经鼻腔给药后对小鼠肺部损伤性进行了初步考察。组织学观察表明，PEI／DNA组鼻腔给药后肺部出现了中等程度的炎症，而修饰的PEI／DNA组则只产生轻度的炎症，说明对PEI进行修饰能显著降低复合物对肺的损伤，具有良好的生理适应性。第二部分 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究 苯甲酸利扎曲普坦（Rizatriptan benzoate，以下将利扎曲普坦简称为RIZA）为新一代5-HT1B／1D受体激动剂，用于成人有先兆或无先兆偏头痛的急性治疗。RIZA目前临床应用的给药途径为口服给药，但常规的片剂并非偏头痛治疗的最佳制剂，因为吞服片剂或喝水会加重偏头痛导致的恶心和呕吐；再次偏头痛所导致的胃肠道副反应（呕吐，胃肠道动力低下，胃排空延缓等）往往会影响药物的吸收，延缓药效。因此，研制一种有效、便捷的新剂型和给药方法具有较高的临床意义。 鼻腔给药是近年来研究较多的给药途径之一，不仅具有药物吸收迅速、无首过效应、给药方便、患者顺应性强等优点，而且还具有向脑内递药的特性。上述特点均有利于中枢启动型药物RIZA以鼻腔给药方式应用于临床偏头痛的治疗。本课题拟将RIZA制成鼻腔喷雾剂，评价其给药后的体内药物动力学及脑内递药特性，旨为RIZA临床应用提供有效便捷的新剂型。 第一章将RIZA制成鼻腔喷雾剂并建立了专属性强、灵敏度高的高效液相色谱检测方法，用于制剂的含量分析和有关物质检查；在鼻腔喷雾剂的质量可控性上，进行pH值、每喷主药含量和有关物质等项目的考察；此外，还进行了初步稳定性试验，为制剂有效期的确定提供参考。 第二章对RIZA鼻腔喷雾剂的安全性进行了考察。采用在体蟾蜍上颚模型考察了RIZA鼻腔喷雾剂对粘膜纤毛运动的影响；应用扫描电镜考察了RIZA鼻腔喷雾剂对大鼠鼻粘膜形态及纤毛数量的影响，从而综合评价制剂的鼻粘膜毒性。结果表明，RIZA鼻腔喷雾剂和基质均无明显的鼻纤毛毒性。 第三章以市售RIZA片剂为参比，评价了RIZA鼻腔喷雾剂的人体生物利用度。首先创建了反相高效液相色谱—荧光检测法测定血浆中RIZA的浓度，并经方法学评价，各项分析方法的效能指标均符合生物样品的测定要求。测定了16位健康受试者鼻腔给予RIZA喷雾剂后的血浆RIZA浓度，并与片剂口服后的血浆RIZA浓度比较。结果表明，鼻腔喷雾剂与片剂生物等效，平均相对生物利用度为96.4％±15.7％，但鼻腔喷雾剂达峰时间明显短于口服给药，提示起效时间可能快于口服给药。 第四章建立了测定大鼠血浆和脑脊液中RIZA浓度的HPLC检测方法，经方法学考察，该分析方法符合生物样品分析要求，可用于大鼠给药后RIZA血浆和脑脊液中药动学研究。本研究选择静脉注射、鼻腔和口服给药途径，比较经不同途径给药后大鼠CSF及血浆中RIZA药动学行为的差异；以药物靶向指数为指标，评价RIZA经鼻腔给药后的脑内递药特性。结果表明，RIZA鼻腔给药后的药物靶向指数为静脉注射的1.45倍，表明RIZA鼻腔给药后有部分药物可直接通过嗅粘膜吸收转运入脑，具有一定的脑内递药特性。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分 聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价

前言

第一章 结核杆菌DNA疫苗pcDNA85btPA质粒的设计、构建及鉴定

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 菌种的复苏与冻存

2.2 感受态细菌的制备和质粒的转化

2.3 质粒DNA的小量抽提

2.4 DNA提取

2.5 目的基因85b基因的分离和扩增

2.6 重组pcDNA85b质粒的构建及鉴定

2.7 tPA信号肽基因序列的扩增

2.8 重组pcDNA85btPA的构建及鉴定

2.9 pcDNA85btPA质粒的大量纯化

3 结果

3.1 结核杆菌抗原Ag85b基因的分离和扩增

3.2 tPA信号肽基因序列的分离和扩增

3.3 质粒pcDNA85btPA的构建及鉴定

4 讨论

4.1 以Ag85B编码基因构建DNA疫苗的选择

4.2 真核表达载体的选择

4.3 信号肽tPA的选择

本章小结

参考文献

第二章 PEG化聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究

一、不同比例mPEG-PEI的合成和表征

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 不同修饰度的PEG-PEI的合成

2.2 PEG-PEI的分离纯化

2.2.1 TNBS法测定洗脱液中PEG-PEI的浓度

2.2.2 凝胶色谱法分离PEG-PEI

2.2.3 PEG-PEI脱盐

2.3 PEG-PEI的分子量以及修饰度测定

3 结果与讨论

3.1 不同修饰度的PEG-PEI的合成

3.2 PEG-PEI的分离纯化

3.2.1 TNBS法测定洗脱液中PEG-PEI的浓度

3.2.2 凝胶色谱和超滤法纯化PEG-PEI

3.3 PEG-PEI的分子量以及修饰度测定

二、不同PEG修饰度的PEI/DNA复合物的制备及性质考察

1.材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 质粒的提取

2.2 PEI/DNA和PEG-PEI/DNA复合物的制备

2.3 凝胶电泳阻滞分析

2.4 复合物的包封率测定

2.5 复合物粒径和zeta电位的测定

2.6 MTT法考察复合物的细胞毒性

3 结果和讨论

3.1 PEI或PEG-PEI/DNA复合物的制备

3.2 凝胶电泳阻滞分析

3.3 复合物的包封率测定

3.4 复合物粒径和zeta电位的测定

3.5 复合物的细胞毒性评价

三、不同PEG修饰度的PEI/DNA复合物的体内外转染效果评价

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 各种PEI/DNA,PEG-PEI/DNA复合物的制备

2.1.1 用于体外细胞转染的复合物的制备

2.1.2 用于体内转染效果评价的复合物的制备

2.2 绿色荧光蛋白报告基因评价体外细胞转染效率

2.2.1 细胞的培养

2.2.2 细胞的转染

2.3 虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率

2.4.动物给药方法

2.5 组织切片方法定性评价复合物经动物鼻腔给药后绿色荧光蛋白报告基因在肺部的表达

2.6 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3 结果和讨论

3.1 PEI/DNA,PEG-PEI/DNA复合物的制备

3.2 绿色荧光蛋白评价体外细胞转染效率

3.3 虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率

3.4.动物给药方法

3.5 组织切片方法定性评价复合物经动物鼻腔给药后绿色荧光蛋白报告基因在肺部的表达

3.6 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3.7 PEI-PEG/DNA复合物体内外转染效果综合评价

本章小结

参考文献

第三章 糖基修饰PEG化聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究

一、糖基—PEG—聚乙烯亚胺的合成和表征

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 PEI与NHS-PEG-MAL基团反应的特性

2.2 Gala与NHS-PEG-MAL的连接

2.3 不同糖基修饰的PEI的合成

3 结果和讨论

3.1 糖基与基因转染材料的连接方法选择

3.2 PEI中的氨基与NHS-PEG-MAL基团反应的特性

3.3 Gala与NHS-PEG-MAL的连接

3.4 Gala-PEG-PEI的合成

4 结论

二、Gala-PEG-PEI/DNA复合物的制备及性质考察

1.材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 质粒的提取

2.2 0.5%Gala-PEG-PEI/DNA,1%Gala-PEG-PEI/DNA,5%Gala-PEG-PEI/DNA复合物的制备

2.3 凝胶电泳阻滞分析

2.4 复合物的包封率测定

2.5 复合物粒径和zeta电位的测定

2.6 MTT法考察复合物的细胞毒性

3 结果和讨论

3.1 0.5%Gala-PEG-PEI/DNA,1%Gala-PEG-PEI/DNA,5%Gala-PEG-PEI/DNA复合物的制备

3.2 凝胶电泳阻滞分析

3.3 复合物的包封率测定

3.4 复合物粒径和zeta电位的测定

3.5 复合物的细胞毒性评价

三、Gala-PEG-PEI/DNA复合物的体内外转染效果评价

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 各种PEI/DNA,Gala-PEG-PEI/DNA复合物的制备

2.1.1 用于体外细胞转染的复合物的制备

2.1.2 用于体内转染效果评价的复合物的制备

2.2 体外细胞转染实验

2.2.1 细胞的培养

2.2.2 细胞的转染

2.2.3 绿色荧光蛋白报告基因评价体外细胞转染效率

2.2.4 虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率

2.3 体内动物转染实验

2.3.1 动物给药方法

2.3.2 组织切片方法定性评价复合物经动物鼻腔给药后绿色荧光蛋白报告基因在肺部的表达

2.3.3 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3 结果和讨论

3.1 绿色荧光蛋白报告基因评价体外细胞转染效率

3.2 虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率

3.3 组织切片方法定性评价复合物经动物鼻腔给药后绿色荧光蛋白报告基因在肺部的表达

3.4 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3.5 Gala-PEG-PEI/DNA复合物体内外转染效果综合评价

本章小结

参考文献

第四章 HIV-1 Tat蛋白修饰聚乙烯亚胺作为基因递释载体的研究

一、mPEG-Tat复合物的合成和Tat蛋白修饰的PEI/DNA复合物的制备及性质考察

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 PEG-Tat的合成

2.2 Ellman法测定mPEG—MAL与Tat的反应程度

2.3 PEI-PEG-1/PEG-Tat/DNA复合物的制备

2.4 凝胶电泳阻滞分析

2.5 复合物的包封率测定

2.6 复合物粒径和zeta电位的测定

2.7 MTT法考察复合物的细胞毒性

3 结果和讨论

3.1 mPEG-Tat的合成

3.2 Ellman法测定mPEG—MAL与Tat的反应程度

3.3 Tat蛋白修饰的PEI/DNA复合物的制备

3.4 凝胶电泳阻滞分析

3.5 复合物的包封率测定

3.6 复合物粒径和zeta电位的测定

3.7 复合物的细胞毒性评价

二、PEI-PEG-1/PEG-Tat/DNA复合物的体内外转染效果评价

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 各种PEI/DNA,PEI-PEG-1/PEG-Tat/DNA复合物的制备

2.1.1 用于体外细胞转染的复合物的制备

2.1.2 用于体内转染效果评价的复合物的制备

2.2 细胞培养

2.3 细胞的转染

2.4 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3 结果和讨论

3.1 虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率

3.2 虫荧光素酶活性法定量评价复合物经动物鼻腔给药后虫荧光素酶报告基因在肺部的表达

3.3 PEI-PEG-1/PEG-Tat/DNA复合物体内外转染效果综合评价

本章小结

参考文献

第五章 修饰的PEI/pcDNA85btPA复合物免疫效果的初步评价

1 材料和仪器

2 方法

2.1 动物免疫及样品收集

2.2 免疫学评价

2.2.1 ELISA检测血清IgG、鼻洗液IgA

2.2.2 特异性淋巴细胞增殖实验

2.2.3 特异性IFN-γ的诱导和测定

3 实验结果

3.1 血清Ag85B抗体的水平

3.2 特异性淋巴细胞增殖实验

3.3 特异性IFN-γ的水平

4 讨论

4.1 DNA疫苗

4.2 免疫途径

4.3 载体

4.4 检测指标

本章小结

参考文献

第六章 修饰的PEI/DNA复合物鼻腔给药的生理适应性研究

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 动物给药

2.2 石蜡包埋切片的制作

3 结果和讨论

参考文献

总结

创新和发现

后续工作及展望

第二部分 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究

前言

参考文献

第一章 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及质量评价

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 实验方法

2.1 处方设计和筛选

2.2 影响因素试验

2.3 RIZA含量分析方法的建立

2.3.1 溶液配制

2.3.2 含量测定方法

2.4 RIZA鼻腔喷雾剂的质量评价

2.4.1 性状

2.4.2 鉴别

2.4.2.1 化学鉴别反应

2.4.2.2 HPLC保留时间鉴别

2.4.3 pH值

2.4.4 装量差异

2.4.5 每瓶总喷次

2.4.6 每喷主药含量

2.4.7 有关物质

2.4.8 40℃加速试验

3 结果

3.1 处方筛选

3.2 影响因素试验结果

3.3 制剂处方及工艺

3.3.1 RIZA鼻腔喷雾剂处方

3.3.2 制备工艺

3.4 含量测定和降解产物测定方法及其评价

3.4.1 色谱条件

3.4.2 方法专属性

3.4.3 降解产物的干扰情况

3.4.5 线性关系试验

3.4.6 检出限

3.4.7 回收率

3.4.8 精密度

3.4.9 稳定性

3.5 质量评价结果

3.5.1 外观性状结果

3.5.2 鉴别

3.5.2.1 化学鉴别反应结果

3.5.2.2 HPLC保留时间测定结果

3.5.3 pH值测定结果

3.5.4 装量差异

3.5.5 每瓶总喷次检查结果

3.5.6 每喷主药含量测定结果

3.5.7 有关物质测定结果

3.5.8 含量测定结果

3.6 40℃加速试验结果

4 讨论

4.1 色谱条件选择

4.2 处方筛选

4.3 有效期的确定

参考文献

第二章 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的安全性评价

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 动物

2 实验方法

2.1 RIZA鼻腔喷雾剂对蟾蜍上颚粘膜纤毛运动的影响

2.2 RIZA鼻腔喷雾剂对大鼠鼻粘膜及纤毛形态的影响

3 实验结果

3.1 鼻腔喷雾剂对蟾蜍上颚粘膜纤毛运动的影响

3.2 鼻腔喷雾剂对大鼠鼻粘膜及纤毛形态的影响

3.3 结论

4 讨论

4.1 实验方法的选择

4.2 给药体积的选择

参考文献

第三章 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的人体生物利用度研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法

2.1 人血药浓度测定方法的建立及其评价

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 RIZA对照溶液的配制

2.1.1.2 内标佐米曲普坦溶液的配制

2.1.2 色谱条件

2.1.3 血样预处理

2.1.4 标准曲线

2.1.5 随行标准血样处理

2.1.6 方法灵敏度

2.1.7 提取回收率

2.1.8 方法回收率

2.1.9 精密度

2.1.10 样品的稳定性

2.1.10.1 样品存放期间的稳定性

2.1.10.2 样品冻融稳定性

2.1.10.3 样品重组后的稳定性

2.2 RIZA鼻腔喷雾剂人体生物利用度试验

2.2.1 研究对象

2.2.2 给药方案和血样采集

3 实验结果

3.1 受试者血药浓度侧定方法及其评价

3.1.1 方法专一性

3.1.2 血药浓度标准曲线方程

3.1.3 方法灵敏度

3.1.4 提取回收率

3.1.5 方法回收率和天内、天间精密度

3.1.6 样品的稳定性

3.2 RIZA鼻腔喷雾剂人体生物利用度研究

3.2.1 血药浓度—时间数据

3.2.2 主要药动学参数

3.2.3 生物等效性评价

4 讨论

4.1 测定方法

4.2 鼻腔喷雾剂的优点和耐受性

参考文献

第四章 苯甲酸利扎曲普坦的脑内递药特性研究

1 材料与仪器

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 动物

2 方法

2.1 大鼠体内分析方法的建立

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 RIZA对照溶液的配制

2.1.1.2 内标佐米曲普坦溶液的配制

2.1.2 生物样品预处理

2.1.3 色谱条件

2.2 RIZA鼻腔给药的脑内递药特性研究

2.3 数据处理

3 结果

3.1 大鼠体内分析方法及其评价

3.1.1 专一性

3.1.2 标准曲线

3.1.2.1 血浆标准曲线

3.1.2.2 CSF标准曲线

3.1.3 方法回收率

3.1.4 提取回收率

3.1.5 精密度

3.1.6 检测限

3.2 RIZA鼻腔给药的脑内递药特性研究结果

3.2.1 不同途径给药后RIZA血药和脑脊液—时间数据

3.2.2 三种途径给药后RIZA体内的药动学分析与评价

3.2.3 鼻腔给药后脑内递药特性评价结果

4 讨论

4.1 脑脊液连续采集方法

4.2 动物的麻醉

4.3 大鼠口服给药后的绝对生物利用度

4.4 药物经鼻给药后的两种入脑途径和RIZA脑内递药特性的分析

参考文献

论文创新性

综述

致谢

已发表文章

发布时间: 2007-06-28

参考文献

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• [4].缺失突变HCV核蛋白DNA免疫效果的初步评价[D]. 洪沙.第四军医大学2005
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