Citicoline对多巴胺能神经元的神经保护作用及其机制

论文摘要

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是以震颤、肌肉僵直和运动弛缓等一系列症状为临床特征的中枢神经退行性疾病,其主要病理改变为中脑黑质多巴胺（DA）能神经元变性坏死。目前,对PD的治疗仅限于对症治疗,不能从根本上阻止病变的进展,长期应用传统药物左旋多巴,会出现毒副作用。因此,寻找新的预防和保护PD的药物,研究其作用机制及途径,为临床应用提供实验依据,从根本上预防PD的发生和阻止疾病的进展,已成为当前研究的热点。胞二磷胆碱（CC）为最有前途的神经保护剂之一,临床上主要用来治疗脑血管病,其安全、价廉。80年代初有报道,CC用于PD的辅助治疗。为了探讨其老药新用的机制,本实验采用15 d胎龄的大鼠胚胎腹侧中脑进行原代培养,用6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PD体外细胞模型,按PD发病机制假说设计,即线粒体功能障碍、兴奋性神经毒、氧化应激、凋亡、免疫因子与炎症等,探讨CC对6-OHDA所致的PD模型中DA能神经元的保护作用及其机制。结果表明:CC可以通过维持线粒体膜电位及膜通透性、减少LDH的漏出保护线粒体功能;减少细胞内钙离子浓度,降低谷氨酸兴奋性神经毒作用;减少活性氧产生,增加抗氧化酶活力,达到抗氧化应激作用;通过上调bcl-2和下调bax路径,抑制神经细胞凋亡;作用于S期,使其细胞百分比增加,增加DNA合成,增强细胞活力。通过以上各方面的相互作用证实CC是一种安全有效的神经保护剂。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1 PD 的流行病学
• 2 PD 的病因及危险因素
• 2.1 病因
• 2.2 PD 的危险因素
• 3 PD 的发病机制
• 3.1 线粒体的损伤
• 3.2 兴奋神经毒作用
• 3.3 氧化应激
• 3.4 神经细胞凋亡
• 3.5 脑内免疫学假说
• 3.6 铁离子与 PD 的关系
• 4 PD 的治疗
• 4.1 药物治疗
• 4.2 PD 的外科治疗
• 4.3 基因治疗
• 4.4 针灸治疗 PD
• 4.5 神经保护性治疗
• 5 PD 的模型建立
• 5.1 PD 体外细胞模型
• 5.2 PD 体内细胞模型
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 实验备品
• 2 方法
• 2.1 大鼠体外 PD 和 CC 神经保护实验模型建立
• 2.1.1 中脑细胞的原代培养
• 2.1.2 PD和 CC 神经保护实验模型制作
• 2.1.3 实验分组
• 2.1.4 实验流程
• 2.2 TH 免疫组化
• 2.3 TH 抗体蛋白检测
• 2.4 细胞活力检测
• 2.4.1 6-OHDA 作用于中脑原代培养细胞的量效和时程关系
• 2.4.2 CC 对中脑原代培养细胞的作用
• 2.4.3 CC 作用不同天数对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 2.4.4 CC 对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 2.4.5 谷氨酸兴奋性神经毒作用
• 2.4.6 CC 对谷氨酸神经毒的保护作用
• 2+]i 检测'>2.5 细胞内[Ca²⁺]i 检测
• 2.6 神经细胞周期及凋亡检测
• 2.7 凋亡相关蛋白检测
• 2.8 抗氧化应激作用检测
• 2.8.1 细胞内活性氧水平的测定
• 2.8.2 抗氧化酶类检测
• 2.8.3 丙二醛检测
• 2.9 NO 及 NOS 检测
• 2.9.1 样本处理
• 2.9.2 一氧化氮
• 2.9.3 一氧化氮合酶
• 2.10 线粒体膜电位（Δψm）检测
• 2.11 乳酸脱氢酶（LDH）漏出检测
• 2.12 荧光显微镜观察细胞膜通透性
• 3 统计学方法
• 第三章 实验结果
• 1 细胞活力检测结果（MTT 法）
• 1.1 6-OHDA 作用于培养体系的时程、剂量反应关系
• 1.1.1 6-OHDA 作用于培养体系0.5 h 的细胞活力
• 1.1.2 6-OHDA 作用于培养体系2 h 的细胞活力
• 1.1.3 6-OHDA 作用于培养体系6 h 的细胞活力
• 1.1.4 6-OHDA 作用于培养体系24 h 的细胞活力
• 1.1.5 6-OHDA 作用于培养体系48 h 的细胞活力
• 1.2 加入不同浓度和次数的 CC 对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.2.1 2mmol/LCC 加入不同次数对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.2.2 1mmol/LCC 加入不同次数对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.2.3 0.1 mmol/LCC 加入不同次数对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.2.4 0.01 mmol/LCC 加入不同次数对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.2.5 0.001 mmol/LCC加入不同天数对6-OHDA神经毒的保护作用
• 1.3 不同浓度 CC 对中脑原代培养细胞的作用
• 1.4 不同浓度 CC 对6-OHDA 神经毒的保护作用
• 1.5 谷氨酸兴奋性神经毒作用
• 1.5.1 不同浓度谷氨酸对中脑原代培养细胞活力的影响
• 1.5.2 CC 对谷氨酸所致损伤的保护作用
• 2 形态学观察
• 2.1 中脑细胞原代培养第6 d 形态学观察
• 2.2 荧光显微镜下观察细胞膜通透性
• 2.3 TH 免疫组化和 TH 阳性细胞观察
• 2+]i检测结果'>3 细胞内游离钙[Ca²⁺]i检测结果
• 4 TH 抗体蛋白表达检测
• 5 线粒体膜电位（Δψm）检测结果
• 6 培养上清中 LDH 漏出检测结果
• 7 氧化应激相关物质检测结果
• 7.1 活性氧的检测结果
• 7.2 氧化应激相关酶类检测结果
• 7.2.1 过氧化氢酶
• 7.2.2 超氧化物歧化酶
• 7.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶
• 7.3 丙二醛检测结果
• 8 凋亡检测结果
• 9 凋亡蛋白检测结果
• 10 CC 对 PD 模型中神经细胞周期的影响
• 11 一氧化氮合酶检测结果
• 12 一氧化氮检测结果
• 第四章 讨论
• 1 多巴胺能神经元的鉴定
• 2 6-OHDA对多巴胺能神经元的神经毒作用及其机制
• 3 神经保护药治疗PD现状
• 3.1 神经保护剂发挥其作用的机制
• 3.2 神经保护剂对抗6-OHDA 的神经毒作用
• 4 神经保护剂CC的保护作用
• 4.1 CC 保护线粒体功能
• 4.2 CC 对抗谷氨酸兴奋性神经毒作用
• 2+]i 浓度减少凋亡'>4.3 CC 能降低细胞内[Ca²⁺]i 浓度减少凋亡
• 4.4 CC 抑制神经细胞凋亡作用
• 4.5 CC 对抗氧化应激作用
• 4.5.1 CC 减少活性氧的产生
• 4.5.2 CC 增加抗氧化酶的活性
• 4.5.3 CC 能减少丙二醛的量
• 4.6 CC 对 PD 模型中一氧化氮的作用
• 4.7 CC 对 PD 模型中一氧化氮合酶的作用
• 4.8 CC 对 PD 模型中细胞周期的作用
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表论文
• 课题项目
• 致谢
• 附图
• 中文摘要
• 英文摘要