有机磷农药降解菌的筛选及其降解酶特性

论文摘要

1 有机磷农药降解菌的分离、鉴定 从福建三明农药厂附近的土壤分离、筛选获得一株能够高效降解甲基1605、辛硫磷、三唑磷等有机磷农药的菌株JS018，该菌在LB平板培养基上形成的菌落为粉红色，圆形，有光泽；经电镜观察，为小球状菌，直径0.5μm～0.75μm；革兰氏染色为阴性；能够在30℃～38℃温度范围内和pH7.0～9.0范围内很好的生长，最适生长温度为32℃，最适pH7.5～8.0；在含有6％NaCl以上的培养基中，不能生长。抗生素敏感性实验表明：JS018菌对安比西林、青霉素、林肯霉素有抗性；对卡那霉素、四环素、庆大霉素等敏感。碳源发酵实验表明：该菌株能发酵葡萄糖，发酵海藻糖、松三糖、乙醇；不能发酵阿拉伯糖、蔗糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖等；不能利用棕檬酸盐，不能液化明胶，不产生硫化氢，能还原硝酸盐，不产生吲哚，接触酶阳性，脲酶阳性。根据其形态特征，生理生化特性、16S rDNA序列分析，初步鉴定JS018为Roseomonas（玟瑰单胞菌属），Roseomonas共有6个基因型种，其中的三个已正式命名，另外三个还没有正式命名。从16S rDNA序列同源性分析，JS018与Roseomonas genomospecfes 4同源性最高，而从其它生理生化特征分析，尤其是对七叶苷水解、甘露糖氧化、葡萄糖发酵等方面与Roseomonas属的6个基因型种都有差别，JS018菌很可能是一种新种，国内还没有关于Roseomonas属的任何菌株的报道，且国内外尚未报道过该属内有降解农药的菌株。 2 JS018菌对农药的降解性能及产酶条件的优化 JS018对甲基1605、辛硫磷、三唑磷、敌敌畏等有机磷农药的降解率很高，在LB培养基中发酵36小时，降解率分别为96％、99％、98.9％、69.0％；对喹硫磷、马拉辛硫磷的降解率较高，分别为49.3％、49.4％；而对毒死婢几乎不降解，对溴氰菊酯和甲氰菊酯的降解率也非常低，几乎也不降解。 JS018产酶的最适培养基配方为：0.07％KH2PO4，0.03％K2HPO4，0.02％MgSO4，0.1％葡萄糖，0.1％酵母粉，最适温度为37℃，pH7.0。 3 JS018菌有机磷农药降解酶的纯化及同源性分析 JS018菌有机磷农药降解酶经硫酸铵分级沉淀，Sephadex G-100凝胶过滤，

论文目录

• 独创性声明
• 论文使用授权的说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 第一节 农药残留及危害概况
• 1 农药残留对食品的污染
• 2 残留农药对饲料的影响
• 3 残留农药对环境的影响
• 4 农药的危害
• 第二节 农药残留的控制概况
• 1 控制农药残留的对策
• 2 消除农药残留的研究
• 2.1 化学降解
• 2.2 光化学降解法
• 2.3 超声波诱导降解法
• 2.4 电离辐射
• 2.5 洗涤剂
• 3 生物降解
• 第三节 有机磷农药微生物降解的研究进展
• 1 有机磷农药降解微生物的种类
• 2 有机农药微生物降解的途径
• 3 有机磷农药降解酶及基因的研究
• 4 有机磷农药微生物降解的研究方向及发展趋势
• 5 存在的问题及展望
• 第五节 研究目的、意义与设计策略
• 第二章 甲基1605降解菌的分离和鉴定
• 第一节 甲基1605降解菌的分离、筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 甲基1605降解菌的分离
• 1.3 降解产物的分析
• 1.4 内生菌、JS018菌对甲基1605降解能力的测定
• 2.结果及分析
• 2.1 土样农药降解菌的分离
• 2.2 降解产物的鉴定
• 2.3 内生菌、JS018菌对甲基1605的降解能力
• 3 小结与讨论
• 第二节 JS018菌株的鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 JS018菌的形态观察
• 1.3 JS018菌生长曲线,最适温度、最适pH的测定
• 1.4 生理生化特性测定
• 1.5 抗生素敏感性试验
• 1.6 16SrDNA序列分析
• 1.7 细菌自动鉴定系统鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 JS018菌的形态观察
• 2.2 JS018生长曲线
• 2.3 JS018菌抗药性测定
• 2.4 JS018生理生化特性
• 2.5 16SrDNA序列分析
• 2.6 细菌自动鉴定系统鉴定
• 3、小结与计论
• 第三章 JS018菌农药降解谱的测定
• 第一节 JS018菌农药降解谱的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 JS018菌对几种有机磷农药的耐受浓度（平板生长法）
• 1.3 JS018菌种子液的培养
• 1.4 JS018菌对有机磷农药的降解能力的测定
• 1.5 JS018菌对拟除虫菊酯类农药降解能力的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 JS018菌在有机磷含农药和拟菊酯类农药平板上的生长
• 2.2 JS018菌对几种有机磷农药和菊酯类农药的降解能力的测定
• 3 小结与讨论
• 第二节 JS018菌生长及产酶条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 菌体生长量测定方法
• 1.3 甲基对硫磷降解酶活性测定方法
• 1.4 不同N源对JS018菌生长和产酶的影响
• 1.5 不同C源对JS018菌生长与产酶的影响
• 1.6 不同浓度的葡萄糖对菌生长以及产酶的影响
• 1.7 不同浓度的酵母粉对菌生长以及产酶的影响
• 1.8 不同离子、添加物和微量元素对菌生长以及产酶的影响
• 1.9 培养条件的优化
• 1.10 差异显著性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同N源对JS018菌生长和产酶的影响
• 2.2 不同C源对JS018菌生长与产酶的影响
• 2.3 不同浓度的葡萄糖对菌生长以及产酶的影响
• 2.4 不同浓度的酵母粉对菌生长以及产酶的影响
• 2.5 不同离子、添加物和微量元素对菌生长以及产酶的影响
• 2.6 培养条件的优化
• 3 小结与讨论
• 第四章 JS018菌有机磷农药降解酶特性的研究
• 第一节 JS018菌有机磷农药降解酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 细菌培养
• 1.3 产酶曲线的测定
• 1.4 降解酶（OPD）存在位置的研究
• 1.5 硫酸铵盐析沉淀OPD
• 1.6 Sephadex G-100柱层析纯化OPD
• 1.7 PAGE非变性胶电泳检测OPD纯度
• 1.8 DEAE-52柱层析
• 1.9 SDS-PAGE法测定OPD分子量
• 1.10 降解酶N末端氨基酸残基序列测定
• 1.11 酶活力测定
• 1.12 蛋白质浓度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作
• 2.2 蛋白质浓度的测定
• 2.3 JS018菌在发酵培养液中的产酶曲线
• 2.4 OPD存在位置
• 2.5 最适酶盐析硫酸铵饱和度的确定
• 2.6 Sephadex G-100柱层析
• 2.7 PAGE电泳检测OPD
• 2.8 DEAE-52柱层析及酶N末端氨基酸残基序列测定
• 2.9 SDS-PAGE电泳确定OPD分子量
• 3小结与讨论
• 第二节 JS018菌有机磷农药降解酶的特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 反应时间对产物生成量的影响
• 1.3 酶浓度与酶活力的关系
• 1.4 不同试剂对甲基对硫磷降解酶的影响性
• 1.5 pH对甲基对硫磷降解酶的影响及酸碱稳定
• 1.6 温度对甲基对硫磷降解酶的影响及酶的热稳定性
• 1.7 有机溶剂对甲基对硫磷降解酶的影响
• 1.8 不同金属离子对甲基对硫磷降解酶的影响
• 1.9 甲基对硫磷降解酶活性的动力学常数测定
• 2 结果与分析
• 2.1 反应时间对产物生成量的影响
• 2.2 酶浓度与酶活力的关系
• 2.3 不同试剂对酶活的影响
• 2.4 pH对甲基对硫磷降解酶的影响及酶的酸碱稳定性
• 2.5 温度对甲基对硫磷降解酶的影响及酶的热稳定性
• 2.6 有机溶剂对酶活的影响
• 2.7 不同金属离子对JS018菌降解酶活性的影响
• 2.8 甲基对硫磷降解酶活性的动力学分析
• 3 小结与讨论
• 总结与讨论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 致谢