RAPD和ISSR在白术鉴定中的应用

论文摘要

白术（Atractylodes macrocephala Koidz．）为菊科苍术属多年生草本植物，其干燥根茎为著名的传统中药，具有抗肿瘤、抗衰老等功效，是常用的大宗药材。目前面临的问题是白术的两个品系—於术和东术处于混杂状态，急需鉴别、恢复和发展。本试验采用ISSR和RAPD分子标记对於术和东术进行分析，为白术分子鉴别提供依据。於术和东术叶片中含有大量的酚类物质，在基因组DNA提取过程中，其与氧接触极易被氧化成醌而不可逆地结合在DNA上，从而影响DNA的纯度和浓度。本试验在传统CTAB法的基础上，采取先破碎细胞，用除酚缓冲液[100 mmol／L Tris-HC1（pH8．0）；50 mmol／LEDTA（pH 8．0）；700 mmol／LNaCl；2％PVP（W／V）；2％β-巯基乙醇（V／V）]将存在于细胞质中影响DNA提取质量的多酚等次生代谢物质去除后再裂解细胞核，获得了可用于分子生物学研究的基因组DNA。采用正交实验设计优化了RAPD和ISSR反应体系，建立了适合于於术和东术的最佳反应体系：（1）於术东术最优化RAPD反应体系为：在25μl反应体系中含Mg2+2．5mmol／L，Taq酶1．25U，模板50ng，dNTP 0．2mmol／L，引物0．5μmol／L；（2）於术东术最优化ISSR反应体系为：在25μl反应体系中含Mg2+3mmol／L，Taq酶0．75U，模板200ng，dNTP0．25mmol／L．引物0．5μmol／L。从72条RAPD引物中筛选出15条扩增条带清晰且多态性丰富的引物对於术和东术进行分析，结果15个RAPD引物共产生112个位点，其中多态性位点94个，多态性位点百分率为83．9％；从100条ISSR引物中筛选出10条扩增条带清晰且多态性丰富的引物对於术和东术进行分析，结果10个ISSR引物共产生114个位点，其中多态性位点102个，多态性位点百分率为89．5％。RAPD和ISSR两种分子标记聚类分析表明於术和东术混杂，品系间亲缘关系较近，而且同一品系不同个体间的遗传距离变异幅度较大。筛选出的15个RAPD引物均不能鉴别於术和东术：ISSR—PCR电泳带谱上显示ISSR5引物在於术样品中扩增出一条约375bp的特异性条带，为白术分子鉴别提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 白术概况
• 1.1 白术的形态特征
• 1.2 白术的化学成分
• 1.3 白术的药理作用研究
• 1.4 白术的临床应用
• 2 常用的分子标记技术及在中药研究中的应用
• 2.1 中药研究中常用的分子标记技术
• 2.1.1 基于电泳技术和Southern杂交技术为核心的分子标记技术
• 2.1.2 基于电泳技术和PCR技术为基础的分子标记技术
• 2.1.3 DNA序列直接测定法
• 2.1.4 基因芯片
• 2.2 分子标记在中药研究中的应用
• 2.2.1 遗传多样性与种质资源研究
• 2.2.2 物种进化与亲缘关系的研究
• 2.2.3 优良品种和种子种苗鉴别
• 2.2.4 中药真伪、近缘药材及代用品鉴别
• 2.2.5 药材的野生类型与栽培品种的研究
• 2.2.6 中药复方质量分析
• 2.2.7 本草考证与出土中药研究
• 2.2.8 有效成分分布规律与分子标记研究
• 2.2.9 道地药材研究
• 2.2.10 遗传图谱的建立
• 3 研究目的和意义
• 第二章 RAPD和ISSR分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 於术东术基因组DNA的提取及质量检测
• 1.2.2 於术东术RAPD分析
• 1.2.3 於术东术ISSR分析
• 2 结果与分析
• 2.1 於术东术基因组DNA质量检测
• 2.1.1 常规CTAB法和改良CTAB法提取的DNA纯度和浓度分析
• 2.1.2 常规CTAB法和改良CTAB法提取的基因组DNA ISSR-PCR扩增效果比较
• 2.1.3 改良CTAB法提取於术和东术基因组DNA的琼脂糖电泳检测
• 2.1.4 改良CTAB法提取於术和东术基因组DNA浓度和纯度的测定
• 2.2 於术东术RAPD分析
• 2.2.1 RAPD反应体系的正交设计直观分析
• 2.2.2 RAPD引物筛选结果
• 2.2.3 RAPD扩增结果
• 2.2.4 基于RAPD的於术东术聚类结果
• 2.3 於术东术ISSR分析
• 2.3.1 ISSR反应体系的优化结果
• 2.3.2 ISSR引物筛选结果
• 2.3.3 ISSR扩增结果
• 2.3.4 基于ISSR的於术东术聚类结果
• 3 讨论
• 3.1 於术东术基因组DNA的提取
• 3.2 於术和东术RAPD—PCR反应体系的优化
• 3.3 於术和东术ISSR—PCR反应体系的优化
• 3.4 退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响
• 3.5 PCR产物电泳带的统计
• 3.6 RAPD和ISSR分析的差异性
• 3.7 於术东术聚类分析
• 3.8 ISSR用于於术和东术品系鉴定的可行性
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介