论文题目: 假单胞菌TS1138由DL-ATC转化L-半胱氨酸关键酶基因的克隆与表达
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 李洋
导师: 游松,白钢
关键词: 假单胞菌,基因克隆,半胱氨酸,氨甲酰半胱氨酸
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究室从土壤中筛选获得了一株假单胞菌TS1138，可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。本论文对代谢途径中的两种转化酶基因和一种分解酶基因在基因克隆和表达等方面进行了研究，研究结果如下： 以pBluescript SKⅡ为载体，以大肠杆菌w3110 cysB~-为受体菌，鸟枪法成功构建TS1138菌株的基因组随机文库，建立特异性筛选模型从中获得两段基因，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对重组蛋白的功能鉴定可知，这两段基因分别为L-ATC水解酶基因和S-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶基因。实验从分子水平上验证了假单胞菌由DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸S-代途径的正确性。 以NCBI上收录的脱巯基酶基因为参考，自行设计引物，以TS1138菌株基因组DNA为模板，扩增得到一段基因，并表达于大肠杆菌BL21(DE3)内。通过活性检测对重组蛋白进行功能鉴定可知该基因为L-半胱氨酸脱巯基酶基因。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 前言
1.1 L-半胱氨酸结构
1.2 L-半胱氨酸的理化性质
1.3 L-半胱氨酸的应用
1.4 L-半胱氨酸的生产方法
1.5 从DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶法转化机制
1.6 用基因工程技术构建产L-半胱氨酸工程菌
1.7 论文立题背景
第二章 假单胞菌TS1138菌株基因组随机文库的构建和转化酶基因的克隆和表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.3 实验方法
2.3.1 TS1138菌株基因组DNA随机文库的构建
2.3.2 L-ATC水解酶基因和L-SCC酰胺水解酶基因的筛选
2.3.3 目的基因的克隆和序列分析
2.3.4 两个水解酶基因的表达产物分析
2.4 结果与分析
2.4.1 TS1138基因组DNA部分酶切预实验结果
2.4.2 质粒的酶切和去磷酸化以及DNA片段的回收
2.4.3 L-ATC水解酶和L-SCC酰胺水解酶基因的筛选
2.4.4 pBM32质粒插入片段基因的功能分析
2.4.5 pBM32质粒中插入片段的序列分析
2.4.6 两个水解酶基因表达产物的分析
2.4.7 相似性序列分析及序列提交
2.5 本章小结
第三章 TS1138菌株L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆和表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 L-半胱氨酸脱巯基酶基因引物的设计
3.3.2 TS1138菌株L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆
3.3.3 L-半胱氨酸脱巯基酶基因的杂交
3.3.4 L-半胱氨酸脱巯基酶基因的表达
3.3.5 利用Ni-NTA His-Bind螯合层析系统对表达蛋白分离纯化
3.3.6 表达产物的蛋白质电泳分析
3.3.7 TS1138菌株的系统进化关系
3.4 结果与分析
3.4.1 TS1138基因组DNA的提取以及PCR扩增
3.4.2 克隆载体构建以及重组质粒的鉴定
3.4.3 pB-cd质粒中插入片段的序列分析
3.4.4 核酸杂交
3.4.5 L-半胱氨酸脱巯基酶基因表达产物的分析
3.4.6 TS1138菌株进化关系及进化树
3.4.7 向GenBank提交序列
3.5 本章小结
讨论与展望
参考文献
在学期间发表文章目录
致谢
发布时间: 2006-11-27
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