细胞色素P450 BM-3体外定向进化及突变酶性能的研究

论文摘要

来自巨大芽孢杆菌（BacillusMegaterium）的细胞色素P450 BM-3是由细胞色素单加氧酶和依赖NADPH的FMN/FAD还原酶组合而成的单链融合蛋白。它的天然底物是长链饱和或不饱和脂肪酸。通过理性设计得到的P450 BM-3（A74G/F87V/L188Q）突变酶能够催化吲哚生成靛蓝和靛玉红。为了进一步提高P450 BM-3催化吲哚生成靛蓝的活性，同时提高其对吲哚的区域选择性减少副产物的生成，本论文采用体外随机诱变的易错PCR和饱和突变相结合的定向进化策略，以P450 BM-3（A74G/F87V/L188Q）作为亲本酶，进行定向进化，通过筛选获得了三个高酶活突变酶，同时对突变酶性质、突变酶活力改变的分子机制等方面进行了较为系统的研究。首先，建立了E．coli DH5（a）收集突变文库和E．coli BL21表达P450 BM-3的底物活性平板初筛系统，同时在96微孔板高通量筛选方案中提出采用产物靛蓝分析和辅酶NADPH分析相结合的筛选策略。这种底物活性平板和96微孔板双重筛选方法的建立，在降低劳动强度的同时也提高了筛选效率。其次，采用易错PCR随机突变对编码细胞色素P450 BM-3（F87V/A74G/L188Q）的单加氧酶基因片段进行定向进化操作。通过优化PCR体系中的基因体外突变因子Mn2+浓度，确定0.05mmol/L的Mn2+浓度是进行体外诱变的最适浓度，同时发现Mn2+的浓度不仅影响TagDNA聚合酶的活性，而且直接影响到活性克隆的获得。对此条件下建立的突变文库进行筛选，仅通过一轮进化就得到了四个酶活提高的突变酶（I39V，D168N/A225V/K440N，K434R，E435D）。第三，在取得的四个突变酶的基础上，根据易错PCR定向进化获得的突变位点信息，进一步采用饱和突变理性定向进化技术对以上六个氨基酸位点进行饱和性分析，采用同样的筛选方案获得了三个既高于亲本酶也高于易错PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶（D168H，D168L，E435T）。第四，对三个高活力突变酶D168H、D168L和E435T的动力学参数以及基本酶学性质进行了分析。实验结果发现，与亲本酶相比，突变酶具有更高的底物亲和力，Km值分别是：亲本酶为2.2mM，突变酶D168H为1.2mM，突变酶D168L为0.92mM，突变酶E435T为0.78mM，从而使其催化效率(kcat/Km)与亲本酶相比都提高了5倍以上，说明突变的确影响了酶的催化反应特征，同时酶活性的提高也源于酶对底物亲和力的增强。突变酶的最适作用pH和热稳定性基本酶学性质几乎未发生改变，突变酶D168H、D168L和E435T均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生成靛蓝的能力；突变酶D168H，D168L与亲本酶相比，热稳定性略有降低，但突变酶E435T与亲本酶热稳定性几乎相同。第五．对突变酶催化吲哚的电子耦合率以及区域选择性进行了分析。实验结果发现，突变酶D168H电子耦合率在所有突变酶包括亲本酶中都是最低的，仅为8％，与亲本酶相比降低了2倍之多，而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有一定的提高，说明在168位点当用组氨酸替代天冬氨酸时，将极大地影响电子从FMN氧化还原酶区域到亚铁血红素的传递。突变酶D168H、E435T对吲哚的区域选择性得到了提高，主产物靛蓝分别从亲本酶的72％提高到了93％和85％，这种区域选择性的改变进一步显示出定向进化在改造酶分子功能方面所具有的巨大魅力。第六，运用计算机三维结构模拟，对具有代表性的突变酶氨基酸置换所导致的酶结构变化和可能的活力提高机制进行了初步分析、探讨，其结果进一步强调了体外定向进化的重要性。第七，此外，还研究了P450 BM-3催化与吲哚同属芳香烃化合物苯乙烯的反应特性。实验结果表明：P450 BM-3突变酶在水相体系中可以催化苯乙烯合成环氧苯乙烷。当发生E435D突变时，P450 BM-3（E435D）催化苯乙烯的能力与其它P450 BM-3突变酶以及亲本酶相比有一定的提高，进一步强调了435氨基酸残基位点在P450 BM-3结构和功能关系中的重要性。选用P450 BM-3（E435D）作为催化用酶，发现该酶催化苯乙烯反应在20分钟内快速达到平衡；当底物浓度高于8.7mmol/L时，将对酶活性产生很大的影响，产物得率显著下降；P450 BM-3的最适反应温度和pH分别为37℃、pH8.2；在底物浓度为4.4mmol//L，助溶剂DMSO浓度为1.5％时，有助于催化反应的顺利进行。总之，本研究将体外分子定向进化技术用于改造细胞色素P450 BM-3催化吲哚生成靛蓝功能，获得了若干功能改进的突变酶。具有高活力、高区域选择性的突变酶的获得为进一步定向进化P450 BM-3的催化性能提供了更好的进化模板。所有的实验结果不仅有助于我们理解突变酶活力提高的分子机制提供了一些线索，并有助于我们进一步了解细胞色素P450 BM-3结构与功能之间的关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 酶分子体外定向进化研究进展
• 1.2.1 酶体外定向进化常用方法
• 1.2.1.1 易错PCR技术
• 1.2.1.2 饱和定点突变
• 1.2.1.3 DNA改组
• 1.2.1.4 随机引导重组
• 1.2.1.5 交错延伸技术
• 1.2.1.6 过渡模板随机嵌合生长
• 1.2.1.7 随机插入/缺失链互换突变
• 1.2.2 突变体文库筛选技术
• 1.2.3 酶分子体外定向进化的应用
• 1.2.3.1 提高酶的催化活性和稳定性
• 1.2.3.2 对酶进行改造以适应恶劣的人工环境
• 1.2.3.3 改变酶的催化专一性
• 1.2.3.4 创造新的酶活性
• 1.3 细胞色素P450及其研究现状
• 1.3.1 细胞色素P450分布与特征
• 1.3.2 细胞色素P450催化反应类型和机制
• 1.3.3 细胞色素P450 BM-3
• 1.3.3.1 细胞色素P450 BM-3催化反应
• 1.3.3.2 定向进化技术在P450 BM-3研究中的应用
• 1.3.3.3 细胞色素P450 BM-3的应用前景
• 1.4 生产靛蓝的方法
• 1.4.1 植物提取
• 1.4.2 化学法合成靛蓝
• 1.4.3 生物法合成靛蓝
• 1.5 细胞色素P450催化苯乙烯的研究进展
• 1.6 本课题的研究思路和目标
• 参考文献
• 第二章 易错PCR定向进化细胞色素P450 BM-3
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.1.1 宿主菌和质粒
• 2.2.1.2 工具酶
• 2.2.1.3 化学试剂
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要实验仪器
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.4.1 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.3 高通量筛选方法的选择和优化
• 2.2.4.4 定点突变实验设计
• 2.2.4.5 易错PCR定向进化
• 2.2.4.6 P450 BM-3的表达
• 2.2.4.7 P450 BM-3的超声破碎
• 2.2.4.8 P450 BM-3的纯化
• 2.2.4.9 蛋白质电泳
• 2.2.4.10 P450 BM-3含量的测定
• 2.2.4.11 酶催化吲哚的动力学参数测定
• 2.2.4.12 DNA序列的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 高通量筛选方法的选择和优化
• 2.3.1.1 LB活性平板分析条件的确定
• 2.3.1.2 96微孔板高通量筛选的选择和优化
• 2.3.2 定点突变结果与分析
• 2.3.3 P450 BM-3的体外定向进化实验设计
• 2.3.4 易错PCR反应体系的优化
• 2.3.5 突变文库的大量构建
• 2.3.6 高通量筛选结果与讨论
• 2.3.7 高活力突变酶基因的测序
• 2.3.8 亲本型和突变型P450 BM-3的提取和纯化
• 2.3.9 亲本型和突变型P450 BM-3催化吲哚的动力学分析
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 大肠杆菌质粒的提取
• 3.2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.4.3 饱和突变引物的设计和PCR反应条件
• 3.2.4.4 饱和突变文库的构建和筛选
• 3.2.4.5 P450 BM-3突变酶的表达
• 3.2.4.6 P450 BM-3突变酶粗酶液制取
• 3.2.4.7 P450 BM-3含量的测定
• 3.2.4.8 P450 BM-3突变酶催化吲哚分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 饱和定点突变技术PCR扩增结果
• 3.3.2 各个位点饱和突变文库的构建
• 3.3.3 饱和突变文库筛选和DNA测序
• 3.3.4 关键氨基酸残基的鉴定
• 3.3.4.1 168位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较
• 3.3.4.2 225位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较
• 3.3.4.3 434位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较
• 3.3.4.4 435位不同氨基酸突变的突变酶催化性能比较
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 单一突变的细胞色素P450 BM-3突变酶基本酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 P450 BM-3突变酶的表达和纯化
• 4.2.3.2 突变酶和亲本酶光谱分析
• 4.2.3.3 SDS-PAGE电泳
• 4.2.3.4 P450 BM-3突变酶含量的测定
• 4.2.3.5 突变酶催化吲哚的羟基化动力学参数测定
• 4.2.3.6 突变酶电子耦合率的测定
• 4.2.3.7 突变酶区域专一性的测定
• 4.2.3.8 pH对突变酶羟基化吲哚的影响
• 4.2.3.9 亲本酶和突变酶的热稳定性的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 突变酶表达和纯化
• 4.3.2 突变酶吸收光谱分析
• 4.3.3 突变酶动力学特征分析
• 4.3.4 突变酶电子耦合效率的分析
• 4.3.5 突变酶催化吲哚区域选择性的分析
• 4.3.6 pH对突变酶羟基化吲哚生成靛蓝的影响
• 4.3.7 亲本酶和突变酶的热稳定性
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 P450 BM-3突变酶3D结构模建分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 P450 BM-3与动物同工酶的基因序列比较
• 5.2.2 P450 BM-3突变酶的三维结构模建
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 同源序列比较分析
• 5.3.2 突变位点分析
• 5.3.2.1 突变酶D168H的突变位点分析
• 5.3.2.2 突变酶E435T的突变位点分析
• 5.3.2.3 突变酶K434R和K434G的分析
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 P450 BM-3突变酶催化苯乙烯的初步研究
• 6.1 引言
• 6.2.1 菌株和质粒
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 实验仪器
• 6.2.4 实验方法
• 6.2.4.1 P450 BM-3的表达和纯化
• 6.2.4.2 P450 BM-3含量的测定
• 6.2.4.3 P450 BM-3催化苯乙烯反应特性的考察
• 6.2.4.4 分析与检测
• 6.3 结果和讨论
• 6.3.1 产物的分析和鉴定
• 6.3.2 突变酶催化苯乙烯活力的比较
• 6.3.3 底物浓度对P450 BM-3催化苯乙烯的影响
• 6.3.4 反应进程分析
• 6.3.5 pH值对P450 BM-3催化苯乙烯的影响
• 6.3.6 温度对P450 BM-3催化苯乙烯的影响
• 6.3.7 助溶剂DMSO对P450 BM-3催化苯乙烯的影响
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢
• 附录1:64种密码子以及它们所编码的氨基酸
• 附录2:20种标准氨基酸的英文简写和R基团结构
• 附录3:1Kb DNA ladder
• 中英文对照和缩写表